Megasphaera

Содержание

Привет Девочки, с Вами делится своими советами и опытом молодая мамочка Елена, сейчас поговорим о Megasphaera. Конечно некоторые моменты могут отличаться от того как это у вас, поэтому всегда нужно консультироваться со специалистами в той области, но на обычные вопросы, всегда можно найти быстро ответ. Пишите в комментариях свои замечания, вместе доработаем и улучшим, так чтобы было понятно для всех.

Исследование микрофлоры урогенитального тракта мужчин АНДРОФЛОР (24 показателя)

Пакет «Андрофлор» — это 24 показателя, необходимых для диагностики состояния урогенитального тракта. Проводится количественное исследование микрофлоры урогенитального тракта у мужчин методом ПЦР в режиме реального времени.
Профили исследований: Андрофлор и Андрофлор Скрин выявляют ДНК безусловно-патогенных (ИППП) и широкий спектр условно-патогенных микроорганизмов с целью диагностики причин воспалительных заболеваний урогенитального тракта мужчин.
Исследование позволяет выявить причину острого и хронического воспалительного процесса, даже в случае отсутствия характерных признаков заболевания и жалоб.
Учёт и интерпретация результатов реакции осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения.
При наличии в исследуемом образце ДНК условно-патогенных микроорганизмов, указывается количество микроорганизма.

Пакет «Андрофлор» включает в себя:
1. Геномная ДНК человека (ГДЧ)
2. Общая бактериальная масса (ОБМ)
3. Lactobacillus spp.
4. Staphylococcus spp.
5. Streptococcus spp.
6. Corinebacterium spp.
7. Gardnerella vaginalis
8. Megasphera spp. +Veillonella spp. + Dialister spp.
9. Sneathia spp.+Leptotrichia spp. + Fusobacterium spp
10. Ureaplasma urealyticum
11. Ureaplasma parvum
12. Mycoplasma hominis
13. Atopobium claster
14. Bacteroides spp. / Porphyromonas spp. / Prevotella spp
15. Anaerococcus spp.
16. Peptostreptococcus spp. / Parvimonas spp.
17. Eubacterium spp.
18. Haemophilus spp.
19. Pseudomonas aeruginosa /Ralstonia spp. / Burkholderia spp.
20. Enterobacteriaceae spp. / Enterococcus spp.
21. Candida spp.
22. Mycoplasma genitalium
23. Trichomonas vaginalis
24. Neisseria gonorrhoeae
25. Chlamydia trachomatis

Болезни мочеполовой системы являются ведущей причиной нарушения репродуктивной функции у мужчин, наиболее частой причиной которых, являются инфекционно-воспалительный процесс, длительность и интенсивность которого определяет степень нарушений репродуктивной функции.

Часто этиологическими факторами развития инфекционно-воспалительного процесса являются облигатные патогенны и вирусы (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Herpes Simplex Virus типов 1 и 2), однако в последнее годы отмечается существенное увеличение роли условно-патогенных микроорганизмов (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Haemophilus, Candida и широкий спектр других микроорганизмов).

Микроорганизмы – возбудители заболеваний мочеполовой системы у мужчин (по данным литературы)

Пакет «Андрофлор» — это 24 показателя, необходимых для диагностики состояния урогенитального тракта. Проводится количественное исследование микрофлоры урогенитального тракта у мужчин методом ПЦР в режиме реального времени.
Профили исследований: Андрофлор и Андрофлор Скрин выявляют ДНК безусловно-патогенных (ИППП) и широкий спектр условно-патогенных микроорганизмов с целью диагностики причин воспалительных заболеваний урогенитального тракта мужчин.
Исследование позволяет выявить причину острого и хронического воспалительного процесса, даже в случае отсутствия характерных признаков заболевания и жалоб.
Учёт и интерпретация результатов реакции осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения.
При наличии в исследуемом образце ДНК условно-патогенных микроорганизмов, указывается количество микроорганизма.

Megasphaera

Download as PDF

About this page

Anaerobic Cocci and Anaerobic Gram-Positive Nonsporulating Bacilli

Members of the Commensal Microbiota

Among gram-negative anaerobic cocci, Veillonella species are common and considered mainly harmless, or even beneficial, colonizers of the mouth from the early years of life onward, 31 whereas Ac >Megasphaera spp. reside in the human intestine and genitourinary tract, respectively. 21,32,33

Also, gram-positive anaerobic cocci—GPAC, as they are often called in the current literature—are commonly present as part of the human microbiota, residing in the mouth, intestines, and both the female and male genital tract as well as skin. 1,34,35 Only limited knowledge, however, exists about their role as commensal organisms, whereas they are frequently connected to various infections at or close to their colonization sites.

Всегда ли Вы соблюдаете назначения врачей?
Да, они больше знают нас.
44.86%
Не всегда, потому что больше информации можно получить от других рожениц.
19.16%
Соблюдаю, но проверяю отзывы и советы от различных мам.
35.98%
Проголосовало: 214

Anaerobic gram-positive nonsporulating bacilli belong to the commensal microbiota of the digestive tract, and some members are part of the microbiota of the urogenital tract and skin. Bifidobacteria and Collinsella are important bacteria in the development of the gut microbiota. 36 In the elderly, a decrease in the levels of intestinal Bifidobacterium populations is seen with aging. 37 Lactobacilli form an important component of the mucosal microbiota of the gastrointestinal tract, the most prevalent species being Lactobacillus rhamnosus, L. paracasei, L. plantarum, and L. salivarius. 38 In the female genital tract and the rectum, the predominant lactobacilli are L. crispatus and L. iners, in particular, and L. gasseri and L. jensenii. 32,33,39,40 Hydrogen peroxide production by these species, except for L. iners, may help to control the overgrowth of bacterial vaginosis–associated organisms and to protect from obstetric infections during pregnancy. 39 Because of their beneficial characteristics, a variety of Lactobacillus and Bifidobacterium strains are increasingly used as probiotics, aiming to alter the composition of the microbiota. 41

The Human Microbiome

Joanna-Lynn C. Borgogna, Carl J. Yeoman, in Methods in Microbiology , 2017

3.5 CST-IV: Lactobacillus-Depauperate Microbiomes

The CST-IV microbiota is delineated by its Lactobacillus-depauperate state and is associated with the outgrowth of facultative and strict anaerobes including Aerococcus, Atopobium, Corynebacterium, Dialister, Eggerthella, Finegol >Megasphaera , Mobiluncus, Peptoniphilus, Prevotella, Sneathia and Streptococcus spp. ( Ferris et al., 2004, 2007 ; Ravel et al., 2011 ; Srinivasan & Fredricks, 2009 ; Verhelst et al., 2004 ; Verstraelen et al., 2009 ; Zhou et al., 2004, 2007 ). Of these, the monospeciated Gardnerella (G. vaginalis) genus has garnered much attention over the past 60 years since being identified as the likely causative agent of BV by Gardner & Dukes (1954) . Understanding the role of G. vaginalis in BV has been confounded by findings that this bacterium can be isolated from the vagina of 58%–68% of women that lack signs or symptoms of disease ( Sautter & Brown, 1980 ; Totten, Amsel, Hale, Piot, & Holmes, 1982 ) and detected in 33%–50% of 16S rRNA gene profiling efforts ( Ravel et al., 2011 ; Yeoman et al., 2010 ), including all CSTs ( Ravel et al., 2011 ). At least some of this variation may be driven by variation in pathogenic potential among G. vaginalis strains. Despite representing a single species, screening of various enzymatic activities revealed that between 8 and 17 biotypes exist depending on the activities examined ( Benito, Vazquez, Berron, Fenoll, & Saez-Neito, 1986 ; Piot et al., 1984 ) and that these biotypes have differing relationships to disease ( Briselden & Hillier, 1990 ). Subsequent comparative genomic analyses have supported at least four distinct groups that appear genetically isolated ( Ahmed et al., 2012 ). Two studies comparing the genomes of group 4 G. vaginalis isolates obtained from asymptomatic individuals to isolates from symptomatic BV individuals revealed variation in gene content and the sequence compositions of known virulence genes ( Harwich et al., 2010 ; Yeoman et al., 2010 ). These include differences corresponding to greater adherence to epithelial cells, aggregation and biofilm formation of BV isolates ( Harwich et al., 2010 ). Isolates obtained from BV individuals only appear able to degrade and utilize mucin ( Yeoman et al., 2010 ), a potentially key virulence marker ( McGregor et al., 1994 ; Roberton et al., 2005 ). Because 16S rRNA gene sequencing cannot readily distinguish between potentially pathogenic and nonpathogenic G. vaginalis or A. vaginae organisms, such data need to be used with caution when attempting to predict an “unhealthy” vaginal state ( Gajer et al., 2012 ; Hyman et al., 2005 ; Ravel et al., 2011 ; Stoyancheva et al., 2014 ). Gajer et al. (2012) have shown that individuals may exhibit a persisting CST-IV vaginal microbiota without the onset of disease. However, even in the absence of signs and symptoms of disease, it is not clear that CST-IV could be considered a “healthy” state. The microbiology of CST-IV and its strong correlative relationship to the often employed Nugent scoring criteria ( Nugent et al., 1991 ; Ravel et al., 2011 ) suggests that many studies describing an asymptomatic BV, or not measuring clinical signs and symptoms of the disease, may be describing CST-IV individuals. Studies focusing on asymptomatic BV have shown it is associated with various reproductive and gynaecological morbidities ( Gibbs, 2007 ), while those relying entirely on Nugent criteria have blurred the line as to whether morbidities associated with BV are related to its clinical manifestation or a Lactobacillus-depauperate state.

Since being defined in 2011, CST-IV microbiota have been associated with a myriad of adverse clinical morbidities. In a series of molecular-based studies, CST-IV microbiota have been associated with T. vaginalis infection ( Brotman et al., 2012 ), vulvovaginal atrophy ( Brotman, Shardell, Gajer, Fadrosh, et al., 2014 ), high-risk HPV infection ( Dareng et al., 2015 ), a slow HPV remission rate ( Brotman, Shardell, Gajer, Tracy, et al., 2014 ) and increasing CIN severity (a precursor to invasive cervical cancer), regardless of HPV status ( Mitra et al., 2015 ). Women with CST-IV microbiota have reportedly higher IL-6 concentrations in cervical fluid (2- to 2.5-fold) and higher incidence of microbial invasion of the amniotic cavity, intraamniotic infection and histological chorioamnionitis ( Kacerovsky et al., 2015 ). Postmenopausal women predominantly have CST-IV microbiota ( Brotman, Shardell, Gajer, Fadrosh, et al., 2014 ), and among these women, this CST has been associated with signs of vulvovaginal atrophy. Specifically, women who were clinically diagnosed with mild or moderate vulvovaginal atrophy having 25-fold greater odds of being classified as CST-IV vs L. crispatus-dominant CST ( Brotman, Shardell, Gajer, Fadrosh, et al., 2014 ).

It is our view that CST-IV likely represents a vulnerable state that is more susceptible to infection by agents capable of eliciting symptomatic BV, or other gynaecological disease. However, further complicating the issue is that CST-IV can be further stratified to two subgroupings CST-IVa and CST-IVb ( Brotman, Shardell, Gajer, Fadrosh, et al., 2014 ; Gajer et al., 2012 ), which are also evident when using alternate microbial gene markers ( Albert et al., 2015 ), and these subgroupings may have differing relationships to disease. Women with a CST-IV microbiota exhibit the highest vaginal pH of all CSTs ( Ravel et al., 2011 ), and it has been hypothesized that in addition to the depauperation of Lactobacillus spp., increases in select biogenic amines (BAs) may contribute to this observation. Metabolomic studies have shown CST-IV exhibits characteristic increases in several BAs including cadaverine, putrescine and agmatine when compared to women with Lactobacillus-dominant CSTs ( Nelson et al., 2015 ). High concentrations of the BAs putrescine and cadaverine, along with trimethylamine have been associated with the malodour characteristic of BV ( Srinivasan et al., 2015 ; Wolrath, Boren, Hallen, & Forsum, 2002 ; Yeoman et al., 2013 ). Most BAs, with the exception of spermine and spermidine, are produced via specific amino acid decarboxylation reactions and involve the consumption of hydrogen ions and the consequential reduction of intracellular and extracellular acidity ( Kanjee & Houry, 2013 ; Nelson et al., 2015 ). Although host cells are capable of producing putrescine, spermine and spermidine, which play roles in immune regulation, lipid metabolism, nucleic acid stabilization and cell division, other BAs are exclusively of microbial origin ( Pegg, 2009 ). The production of putrescine, cadaverine and agmatine have extensively been described as being used by various bacteria for acid-stress resistance and can protect E. coli at a pH of 2.5 ( Large, Walk, & Whittam, 2005 ). A comprehensive genomic screen of the most prevalent vaginal bacteria indicates that the ability to produce BAs is limited to just a handful of species that are mainly associated with CST-IV and BV. These include members of the genus Mobiluncus, including M. mulieris and M. curtisii, which can produce trimethylamine ( Cruden & Galask, 2009 ). These Mobiluncus species were seen to produce trimethylamine either through the reduction of TMA oxide or weakly through the reduction of choline ( Cruden & Galask, 2009 ). Additionally, the vaginal parasite, T. vaginalis, has been shown to encode an ornithine decarboxylase, necessary for the production of putrescine, spermine and spermidine ( Yarlett, Goldberg, Moharrami, & Bacchi, 1993 ). Accordingly, elevated levels of TMA and putrescine have been associated with diagnosis of BV and with trichomoniasis ( Sobel, Karpas, & Lorber, 2012 ). Based on their observations, Nelson et al. (2015) hypothesize that these BAs may reduce vaginal acidity and thereby decreasing the primary barrier to pathogen outgrowth and/or directly impacting the growth of vaginal Lactobacillus spp. while favouring CST-IV-associated bacteria.

Mechanisms of Disease and Immunity

Robert H. Mealey, Maureen T. Long, in Equine Internal Medicine (Fourth Edition) , 2018

Oral Microbiome

The oral and pharyngeal mucosa is richly populated with many bacteria, including obligate aerobes, anaerobes, and facultative anaerobes. 5 By culture, gram-positive and gram-negative anaerobes are the predominant flora in the mouth and pharyngeal tonsils of the normal horse, with B. fragilis and Bactero >Megasphaera spp. are also cultured. Aerobic and facultative anaerobic populations mostly include S. zooepidemicus, Pasteurella spp., E. coli, Actinomyces spp., and Streptococcus spp. In a 16S metagenomics analysis of the subgingival sites of the horse, although highly diverse, many similarities to human and other species were observed. 6 The most common bacterial phyla included Gammaproteobacteria, Firmicutes, Bactero > The finding of Actinobacillus species is not unexpected; however, by comparison these taxa are relatively absent from cat and dog oral metagenomes. Of the highly abundant Firmicutes, many classes of Bacilli were detected; several Neisseria-like bacteria were detected. Of particular interest is the population of oral spirochetes that reside in the equine mouth because of its relationship to periodontal disease in humans, and although there were Treponema, spirochetes, and leptospires present and abundant, “periodontopathogens” were present in low numbers. When healthy horses were compared with horses with oral disease, Actinobacillus (Gammaproteobacteria) and the Neisseria-like Gemella sp. (Firmicutes) predominated compared with Prevotella (Bacteroidetes) and Veillonella (Firmicutes). 7

The Oral Microbiome in Health and Its Implication in Oral and Systemic Diseases

2.5 Viral Oral Colonization

The human virome is highly complex, and its role on health and disease status still needs to be clarified. Pride, Salzman, Haynes, et al. (2012) have revealed few insights on oral virome describing a persistent community of double-stranded DNA viruses in the saliva of healthy individuals. A large group of the oral viruses are in fact bacteria predators. These bacteriophages might be relevant for the regulation of microbial diversity and simultaneously work as reservoirs of pathogenic gene function in the human oral environment ( Pride, Salzman, Haynes, et al., 2012 ). Putative viruses of Veillonella, Streptococcus, and Megasphaera were recently described and showed how bacteria can interact and be modulated by communities of viruses ( Pride, Salzman, Haynes, et al., 2012; Pride, Salzman, & Relman, 2012 ). The phage ecology and biodiversity in the subgingival crevice of healthy subjects was also studied and compared with the communities found in patients with moderate/severe periodontitis. Saliva and oral biofilm samples collected in a cohort of individuals could reflect the disease status and degree of periodontal disease based on the differences observed on the viral (bacteriophages) communities ( Ly et al., 2014 ). The study concluded that viruses could be grouped according to the tested subject, the biogeographic site, and the oral site where the sample was collected. Interestingly, this last information could not be obtained when bacterial communities were compared. In addition, oral viruses could be significantly associated with the human host sex due to host factors, such as hormones, that play a crucial role on viral ecology and its development ( Abeles et al., 2014 ).

Urethritis, Vulvovaginitis, and Cervicitis

Bacterial Vaginosis.

BV is the most common cause of vaginitis in postpubertal women, affecting approximately one third of women. 63,66–68 BV represents a disruption in the normal vaginal flora, with a decrease in lactobacilli and overgrowth of a variety of primarily anaerobic organisms. BV-associated organisms include G. vaginalis, genital mycoplasmas (M. hominis), U. urealyticum, Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas, Peptostreptococcus, Fusobacterium, and Mobiluncus species. 63,64,69–71 Although many patients with BV have moderate to heavy concentrations of vaginal Gardnerella species, detection of this organism is not diagnostic because vaginal colonization is common in patients without BV and not specific for the diagnosis. 63,64,71

New technologies employing amplification of ribosomal RNA are being used to characterize bacterial species that are not identified by culture 64,70–72 They include three clostr >Megasphaera species, and Eggerthella-like bacteria. 70–72 In one study, detection of these noncultivatable bacteria had excellent sensitivity and specificity for diagnosing BV compared with standard diagnostic criteria. 71

In a multivariate analysis of NHANES data from 2001 through 2004, risk factors for BV included a higher number of lifetime sex partners, douching, low educational achievement, and being non-Hispanic black. 68 BV has also been associated with poverty, smoking, having a female sex partner, high body mass index, and previous pregnancy. 68,73,74 The prevalence of BV among women attending STI clinics is higher (30% to 37%) than among college students (4% to 15%) 7 and the prevalence of BV in a nationally representative sample of 14-19 year old women was 18.5%. 68

BV is more common among adolescents and young adults who are sexually active and have multiple sexual partners. However, designating BV as an STI has been controversial because some studies have found BV in sexually inexperienced females. 64,66,68,75,76 One study of women entering the military found that 19% of subjects denying a history of vaginal intercourse met criteria for BV compared with 28% who had been active sexually. 75 Another study questioned the accuracy of sexual histories having failed to find BV in truly sexually inexperienced college students. 77 Studies have shown a concordance between the presence of G. vaginalis in the urethra of male sex partners of women diagnosed with BV but did not find this organism in male controls. 64 Sexual activity, multiple sexual partners, receptive oral sex, and vaginal insertion of sex toys that were not cleaned are associated with BV, whereas the use of condoms appears to be protective. 64,73,74,77–80 Treatment of sex partners does not appear to prevent recurrence. 64 However, a systematic review of randomized, controlled trials of male partner treatment for BV criticized these studies for having methodologic flaws. 81

Up to one third of women experience recurrent episodes of BV within 3 months of treatment. 66 In one study, factors associated with recurrence over a 12-month period included a history of BV and having a female sex partner or a regular sex partner. 82 Recurrence may be related to reinfection from an infected partner or to failure to re-establish lactobacilli dominance with persistence of pathogenic bacteria. 63,67,72 Some investigators have postulated that the recurrence of BV is related to persistence of a biofilm containing G. vaginalis and other organisms that adheres to the epithelial cells and provides protection from systemic and topical antibiotics. 72,83–85

Microbiota and the Urogenital Tract, Pathogenesis, and Therapies

14.2.2 Microbiota of the female urogenital tract

The normal microbiota of the urogenital tract provides an important nonspecific defense against infectious diseases (refer to section below on function and immunity in the female urogenital system for more details). However, in both men and women, the kidneys are sterile, and the urine has also, in general, been considered sterile ( Dukes, 1939; Osborne, 2008 ). Although urine contains some antibacterial components, bacteria will grow in urine at room temperature, thus, flushing action in the ureters and bladder is a primary mechanism to remove potentially pathogenic bacteria from attaching to the mucosa and initialing an infection. Vaginal microbiota was first discovered by the German gynecologist Albert Döderlein in 1892 ( David, 2006 ), and the normal microbiota of the female urogenital tract is primarily located within the distal one third of the urethra and the vaginal. The mucosal surface of the female genital tract is a complex biosystem that provides a barrier against the outside environment, and participates in both the innate and adaptive immune systems (refer to later section on vaginal immunity). Early studies prior to the 1970s that used conventional culturing techniques favored fast growing and modest bacteria (due to inappropriate transport systems, ineffective culture media, and culturing techniques), and resulted in gross underestimation of the importance of opportunistic bacteria, as major constituents of the normal microbiota of the female urogenital tract ( Larsen and Monif, 2001; Pace, 1997 ). The bacteria in these earlier culture studies may have effective evasion techniques, which may be the result of intracellular bacteria formation in uroepithelial cells ( Rosen et al., 2007 ), or biofilm formation in the urinary tract ( Hancock et al., 2007; Salo et al., 2009 ). More recent culture studies, that utilized more elaborate techniques, of urine specimens from healthy mice and humans has revealed that viable but nonculturable bacteria are present ( Anderson et al., 2004 ), which stressed the importance of utilizing bacterial identification techniques that provide a clear view of the bacterial diversity in urine. More recent studies, using sophisticated nonculture polymerase chain reaction (PCR) gene amplification and advanced high throughput sequencing of 16S rDNA amplicons, have revealed that the female urogenital microbiome is significantly diverse, with the predominant genera detected being Lactobacillus, Prevotella, and Gardnerella ( Pearce et al., 2014; Siddiqui et al., 2011; Witkin et al., 2007 ). However, in otherwise healthy women (especially black and Hispanic women; Zhou et al., 2007 ), where lactobacilli may be deficient or absent ( Hummelen et al., 2010b; Zhou et al., 2004 ), other lactic-ac >Megasphaera , Pediococcus, Streptococcus, Weissella, and/or Leptotrichia ( Ravel et al., 2011; Witkin et al., 2007; Zhou et al., 2004, 2007 ). Thus, even in women with low lactobacilli counts, other lactic-acid-producing bacteria predominate to lower vaginal pH and establish normal vaginal microbiota ( Mirmonsef et al., 2012 ), although pH is known to decrease during pregnancy ( Hillier et al., 1995 ), refer also to section in this chapter on complicated UTIs and pregnancy.

The 16S rDNA PCR sequencing studies also demonstrated significant bacterial diversity, and individual variation, with a total of eleven phyla in female urine identified ( Pearce et al., 2014; Siddiqui et al., 2011 ). The five bacterial DNA sequences predominately found were Firmicutes (60-65%), Bacteroidetes (18%), Actinobacteria (12–16%), Fusobacteria (3%), and Proteobacteria (2%). The six other phyla represented less than 1% of the total determined by sequencing, including Chloroflexi, Spirochaetes, Synergistetes, Fibrobacteres, Acidobacteria, and Tenericutes. Siddiqui et al. (2011) also identified 22 different orders, with the four most abundant orders being Lactobacillales (53%), Bacteroidales (20%), Clostridiales (10%), and Bifidobacteriales (9%). Further analyzing their data, these investigators determined 45 different genera, but about 87–88% of the sequenced genes were assigned to the genera, Lactobacillus, Prevotella, and Gardnerella. Pearce et al. (2014) confirmed these findings, showing that the most frequent urotypes in a nonurgency urinary incontinence cohort group were Lactobacillus (60%) and Gardnerella (12%), in addition to Enterobacteriaceae (8%), and a group of nondescriptive bacteria lacking either a dominant family or genus, “diverse” (20%). Similar results were also seen in studies on male urine composition by Nelson et al. (2010) and Dong et al. (2011) , although Nelson et al. (2010) did not show Lactobacillus and Prevotella as dominant genera, the latter study by Dong et al. (2011) , that used rDNA sequences, showed these genera as dominant. In addition to these genera, many of the genera detected in the urinary microbiome by the 16S sequencing techniques are also found in the vaginal tracts, including Bifidobacterium, Enterococcus, Actinomyces, Prevotella, and Atopobium ( Hyman et al., 2005 ; Ravel et al., 2011 ). Siddiqui et al. (2011) also detected several potentially pathogenic species (Prevotella disiens, G. vaginalis, Aerococcus urinae, Ureaplasma sp., particularly U. urealyticum) in asymptomatic health female urine samples that were also detected in a previous study by Imirzalioglu et al. (2008) , although E. coli was not detected in any urine samples from healthy females.

In more recent study, Shipitsyna et al. (2013) investigated vaginal samples from 163 women (79 as healthy controls, 73 with confirmed BV, and 11 intermediate, having Lactobacillary grade II microbiota) cases using 454 pyrosequencing of the hypervariable regions V3–V4 of the 16S rRNA gene and 16 quantitative bacterial species/genus-specific real-time PCR assays. The investigators found that patients with BV had significantly higher prevalence, loads and relative abundances of the majority of BV-associated bacteria, relative to healthy women. However, only G. vaginalis, Atopobium vaginae, Eggerthella, Prevotella, BVAB2, and Megasphaera type 1 detected at or above thresholds were highly predictable for BV, with the best diagnostic accuracy for A. vaginae. The combination of depleted Lactobacillus spp. and presence of significant G. vaginalis or A. vaginae diagnostic levels was shown to be a highly accurate BV predictor.

These microbiota have been associated with genital tract infections (Prevotella disiens), BV (G. vaginalis or A. vaginae; Shipitsyna et al., 2013 ), preterm delivery ( Fredricks et al., 2005; Menard et al., 2010 ), as uropathogens (G. vaginalis; Domann et al., 2003; Imirzalioglu et al., 2008 ), bladder infection in elderly (Aerococcus urinae; Schuur et al., 1999 ), and chronic urinary symptoms ( Baka et al., 2009; Pedraza Aviles and Ortiz Zaragoza, 1998 ).

Management of Disease and Disorders by Prebiotics and Probiotic Therapy: Probiotics in Bacterial Vaginosis

Bacterial vaginosis

BV, largely defined as a dysbiosis of the vaginal microbiome, is the most common and enigmatic vaginal condition in reproductive-age women with unknown etiology and poorly understood pathogenesis [10,11] .

BV represents an imbalance in the ecology of the normal vaginal microbiota, characterized by a decrease in the prevalence and concentration of Lactobacillus species, and an increase in the prevalence and concentration of several pathogenic bacteria, mainly anaerobes [12] . Conventional culture-dependent analysis of the vaginal microbiota of women with BV identified a typical spectrum of anaerobes, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Mobiluncus mulieris, Prevotella bivia, Fusobacterium nucleatum, Ureaplasma urealyticum, and Mycoplasma hominis [13] . In recent years, culture-independent techniques based on the analysis of rRNA gene sequences have been developed, prov > vaginal ecosystem and to understand community dynamics [8,14–16] . These molecular studies indicate that the vaginal bacterial communities are dramatically different between women with and without BV. BV is associated with increased taxonomic richness and diversity. The microbiota composition is highly variable among subjects at a fine taxonomic scale (species or genus level), but, at the phylum level, Actinobacteria and Bactero >Megasphaera , Leptotrichia, Dialister, and Sneathia [17] . Also, the Vaginal Human Microbiome Project has detected several newly described bacteria in the Clostridiales order, which are currently designated BVAB1, BVAB2, and BVAB3 [18] . All these organisms are of relatively low virulence. Therefore, BV is not caused by the mere presence of the potential pathogens but rather by their unrestrained increase in number, reaching cell counts that are 100- to 1000-fold above the normal bacterial levels in healthy vagina [19] .

Recently, attention has been directed not only to the microbiome associated with BV, but also to the characterization of the vaginal proteome and metabolome. It has been demonstrated that BV is marked by profound changes in the proteome of vaginal fluids, mainly regarding the abundance of proteins involved in the innate immune response [20] . Studies investigating the metabolites produced by lactobacilli-dominated microbiota and polymicrobial BV have shown a striking loss of lactic acid and a shift toward mixed short-chain fatty acids production during BV state [21–23] .

Clinical presentation of BV is typical. Women have an unpleasant, “fishy-smelling” discharge that is more noticeable after unprotected intercourse. The discharge is off-white, thin, and homogeneous. Erythema and inflammation are usually absent, and most patients are asymptomatic [24] . The overgrowth of vaginal anaerobes determines an increased production of amines (putrescine, cadaverine, and trimethylamine) that become volatile at alkaline pH, that is, after sexual intercourse and during menstrual cycle, and contribute to the typical malodour of the vaginal discharge [25] .

The diagnosis of BV is based on clinical criteria (Amsel method) or Gram staining (Nugent method). Amsel method [26] implies the presence of at least three of the following criteria: (1) thin, homogeneous, milky vaginal discharge; (2) vaginal pH higher than 4.5; (3) “fishy” odor of vaginal fluid after addition of 10% KOH (whiff test); and (4) presence of “clue cells” on microscopic evaluation, that are vaginal epithelial cells heavily coated with bacteria of saline wet preparations. Amsel’s criteria, although widely accepted as the best available means to diagnose BV in the clinical setting, may fail to identify women with asymptomatic BV. The second method, the Gram staining score of vaginal smears according to Nugent [27] , involves the microscopic quantitation of bacterial morphotypes yielding a score between 0 and 10 (normal microflora: score ≤ 3; intermediate microflora: score 4–6; BV: score ≥ 7). Nugent score system is generally preferred in the scientific community [28] .

A large body of literature confirms that BV may lead to potentially severe complications and sequelae. Several studies have demonstrated an increased risk of abortion in the first trimester of pregnancy, premature ruptures of the membranes, chorioamnionitis, and preterm birth in women with BV [29–31] . A causal relationship has been established also between BV, pelvic inflammatory disease [32,33] and cervicitis [34] . Moreover, alterations in the vaginal microenvironment have been associated with urinary tract infections [35] . Increasing data also indicates that BV facilitates the acquisition of sexually transmitted diseases, such as Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, HIV, and Herpes simplex virus type-2 infection (HSV-2) [36–42] . In vitro experiments using immortalized vaginal epithelial cells cocultured with common vaginal bacterial species offered some insight into the host–microbe interactions and mucosal immune response to BV. These studies suggest that BV-associated bacteria can induce an innate immune response from the genital epithelium characterized by upregulation of cytokines associated with increased risk of HIV-1 transmission, while commensal lactobacilli exert an antiinflammatory influence [43] .

Current therapy for BV involves oral or intravaginal administration of metronidazole or clindamycin [44] , but long-term follow-up suggests high recurrence rates [45] . The reasons for recurrence may include the failure to eradicate the offending organisms, due to the formation of a prolific bacterial biofilm adhering to the vaginal epithelium. The main components of this polymicrobial biofilm are G. vaginalis and A. vaginae [46] . Using mathematical models, it has been demonstrated that the human microbiome is dynamic within a single anatomic niche and can undergo complete reorganization in less than a day during antibiotic treatment. Within 24 h of metronidazole treatment initiation, most BV-associated bacteria undergo rapid exponential depletion. Levels of Lactobacillus species, particularly L. iners, often surge to fill the transient microbial vacuum. When treatment is stopped anaerobic species quickly reemerge, suggesting a possible role for intermittent prophylactic treatment [47] .

The high recurrence rates, which result in repeated exposure to antibiotics and the emergence of drug-resistant strains, suggest a need for alternative therapeutic tools. Novel antibiotic treatments are progressively being studied, like rifaximin [48] , in order to have more options for switching therapy, combining therapies and long-term prophylactic use to prevent recurrences. In this panorama, probiotics are emerging as good candidates to improve the efficacy of BV therapy as well as to prevent recurrences.

Mechanisms of Infectious Disease

Stephen M. Reed DVM, Dipl ACVIM, . Yasuko Rikihisa, in Equine Internal Medicine (Second Edition) , 2004

Normal Flora

Dermal and mucosal surfaces provide a life-preserving protective barrier composed of physical, chemical, and microbial defenses. Normal flora contributes to this protective barrier against pathogens while paradoxically providing a source for potential opportunistic invasion. Commensal bacteria are those that benefit from living on or within a host without mediating harm. For a relationship to be commensal, it must be mutually beneficial, and the interruption of this association results in abnormal host development or overt disease. 1 A pathogen is any disease-producing organism; thus a commensal organism has the potential to be pathogenic. Colonization is infection without disease. Skin, gastrointestinal, respiratory, and urogenital colonization occurs early in life and persists unless disrupted.

SKIN FLORA

The combination of normal flora and mucosal immunity provides an effective barrier against infectious colonization of nondisrupted skin surfaces. Specific bacteria are stratified by site, and certain bacteria multiple and colonize depending on associated adnexa. 2 Most bacteria and fungi on the surface of the skin are not associated with disease; however, yeast and bacteria within hair follicles are more likely to be related to a disease process. 3 Even though horses inhabit an environment heavily contaminated with fecal flora, normal dermal flora in the horse is surprisingly devoid of members of the Enterobacteriaceae. 4 Normal inhabitants include mixed populations of bacteria of species of Acinetobacter, Aerococcus, Aeromonas, Bacillus, Corynebacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Nocardia, coagulase-negative Staphylococcus, Staphylococcus aureus, Streptomyces, and nonhemolytic Streptococcus generae. 2 Certain Staphylococcus spp. have been associated with skin disease in the horse and these include S. aureus, S. intermedius, and S. hyicus, whereas species such as S. xylosus and S. sciuri more often are associated with normal skin. 5 More than 30 species of fungi can inhabit the skin, and Alternaria, Aspergillus, Candida, Fusarium, Rhizopus, and Trichophyton spp. 2 commonly are present.

ORAL, PHARYNGEAL, AND RESPIRATORY FLORA

Oral and pharyngeal mucosal flora is associated with health and disease of the upper and lower respiratory system. The oral and pharyngeal mucosa is populated richly with many bacteria, including obligate aerobes, anaerobes, and facultative anaerobes. 6 Aerobic and facultative anaerobic populations are comprised mainly of Streptococcus equi, Pasteurella spp., Escherichia coli, Actinomyces spp., and Streptococcus spp. Anaerobes actually predominate in the mouth of the normal horse, and colonization of the oropharynx and mouth consists of members of several bacterial genera. Gram-positive and gram-negative anaerobic species inhabit the pharyngeal tonsillar area, and Bactero >Megasphaera spp. are also common. These same genera are found consistently in horses with lower respiratory infections, indicating that pharyngeal flora is a likely source of contamination. 6 Contamination of the trachea of the horse occurs frequently, as evidenced by the fact that transtracheal aspiration yields positive bacterial cultures in approximately 30% of normal adult horses and foals. 7 As with skin flora, normal horses have multiple fungal species inhabiting conjunctival, nasal, and oral mucosae. Stabling increases the frequency of ocular fungi in normal horses. 8

Читайте также:  Овуляторный Синдром После Лапароскопии

INTESTINAL FLORA

In animal models and chronic human conditions, normal flora is considered important for intestinal maturity and containment of disease. Changes in cecal weight, villus-to-crypt ratio, development of gut immunoglobulin A responses, and volatile fatty acid production are affected by suboptimal cecal colonization in germ-free animals. 9 A relationship between severity of mucosal disease and normal flora also has been demonstrated in models of inflammatory bowel disease of human beings. 10

Bacteria are present in all parts of the intestinal tract of the horse, and the microbial fauna increases in complexity and density aborally. 11 The stomach of the horse is not a sterile environment. A dense population of gram-positive bacterial rods, primarily composed of Lactobacillus spp., colonizes the nonsquamous portion of the equine stomach. Substantial colonization of the duodenum occurs with a large population of proteolytic bacteria, and this colonization increases tenfold in the ileum. 12

Microbial degradation and fermentation of plant material in the large intestine is an important component of nutrient acquisition in the horse. The consumption of cellulose and starch results in the production of volatile fatty acids. 13 The major cellulolytic bacterial species of the large intestine are similar to those of Bovidae, but the strains in the horse produce different arrays of fermentation products. 14 As in cows, Ruminococcus flavefaciens is one of the predominate cellulolytic bacteria of the equine cecum. Overall, gram-negative rods are the most populous bacteria, comprising 50% of flora. Gram-positive rods and cocci each represent around 20% of the bacterial population. Predominant species include members of the Enterobacteriaceae, Butynvibrio spp., Streptococcus spp., Bacteroides spp., Lactobacillus spp., Selenomonas spp., Eubacterium spp., Propionibacterium spp., Staphylococcus spp., and many unclassified rods and cocci. 15 Yeasts and fungi of the order Mucorales have been identified in the cecum of normal horses and are capable of digesting cellulose and starch. 16

The latest investigations demonstrate a lack of intestinal pathogens in the flora of normal horses as detected by routine culturing of feces. In the largest study to date, fecal shedding of Salmonella in normal horses from farms without evidence of salmonellosis was 0.8% in resident horses. 17 Based on limited investigations, the carriage rates of Clostridium difficile in normal horses and foals also appears to be low ( 18 Intestinal flora in the horse is an important source for extraintestinal pathogens. In studies examining the carriage rate of Rhodococcus equi, all horses cultured carried the bacteria regardless of age. 19,20 Furthermore, if the farm had endemic R. equi and respiratory isolates contain the 90-kd plasmid, which has been associated with disease, fecal isolates also contained this plasmid.

UROGENITAL FLORA

By far most of the work that characterizes equine normal flora has focused on urogenital flora in an effort to gain understanding of the role of uterine contamination or infection in fetal loss. Although the vaginal and vestibular mucosae of mares are colonized with normal mucosal flora, the uterus is considered sterile. However, typical culturing techniques result in frequent isolation of what might be considered pathogens, and cytologic examination and bacterial counts are important supplemental tests for detecting true infection. Colony counts less than 10 colony-forming units and lack of inflammatory cells indicate uterine or technical contamination. 21 Many bacteria inhabit the external genitalia of stallions, including those considered to be associated with metritis in mares. The predominant aerobe isolated is coagulase-negative Staphylococcus spp., followed by Corynebacterium spp., α-hemolytic Streptococcus spp., and Lactobacillus spp. Pathogens such as β-hemolytic Streptococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, and Klebsiella spp. can be found frequently in servicing stallions. 22,23 Pregnancy rates appear to be the same in mares bred to stallions with semen infected with P. aeruginosa. 24

FUNGAL FLORA

Essentially the same principles apply regarding normal flora, host immunity, and specific virulence factors for the pathogenesis of fungal infection. Fungal infections can be divided into primary or opportunistic pathogens. True pathogens are less dependent on host status than are opportunistic pathogens, although even a true pathogen may require some degree of alteration of normal flora or host immunity to become established. Long-term antibiotic use, immunosuppression, and compromised organ function especially involving the pulmonary or endocrine system are three primary host factors highly associated with establishment of opportunistic fungal infection. Fungi often can adapt to the mammalian environment over a short time. Adaptation usually requires a change in thermal range, oxygen requirements, and resistance to host defenses.

Vaginitis, Vulvitis, Cervicitis and Cutaneous Vulval Lesions

Bacterial Vaginosis

Ep >Bacterial vaginosis is the most common cause of vaginitis in women of child-bearing age. It has been diagnosed in 17–19% of women seeking gynecologic care in family practice or student healthcare settings. 1 The worldwide prevalence ranges from 11% to 48% of women of reproductive age, with variation according to population studied. 2 The prevalence increases considerably in symptomatic women attending STD clinics, reaching 24–37%. Bacterial vaginosis has been observed in 16–29% of pregnant women. Gardnerella vaginalis has been found in 10–31% of virgin adolescent girls, but is found significantly more frequently among sexually active women, reaching a prevalence of 50–60% in some at-risk populations.

Evaluation of epidemiologic factors has revealed few clues as to the cause of bacterial vaginosis. Use of an intrauterine device and douching was found to be more common in women with bacterial vaginosis. Bacterial vaginosis is significantly more common among black and sexually active women, including lesbians.

Pathogenesis and Pathology

Bacterial vaginosis is not due to a single organism or species and is the result of massive overgrowth of mixed complex flora or microbiota, including Bacteroides spp., G. vaginalis, Mobiluncus spp., genital mycoplasma and previously noncultivable anaerobes. 1 There is little inflammation, and the disorder represents a disturbance of the vaginal microbial ecosystem rather than a true infection of tissues. The overgrowth of mixed flora is associated with a loss of the normal Lactobacillus spp.-dominated vaginal flora. Experimental studies in human volunteers and studies in animals indicate that inoculation of the vagina with individual species of bacteria associated with bacterial vaginosis (e.g. G. vaginalis) rarely results in bacterial vaginosis. There is considerable support for the role of sexual transmission, including the higher prevalence of bacterial vaginosis among sexually active young women than among sexually inexperienced women, and bacterial vaginosis-associated micro-organisms are more frequently iso­lated from the urethras of male partners of females with bacterial vaginosis. 1

The cause of the overgrowth of anaerobes, Gardnerella, Mycoplasma and Mobiluncus spp., is unknown. Theories include introduction of new pathogens, increased pH and loss of the restraining effects of the predominant Lactobacillus spp. flora. Normal women are predominantly colonized by hydrogen peroxide-producing strains of lactobacilli, whereas women with bacterial vaginosis have reduced population numbers of lactobacilli, and the species present lack the ability to produce hydrogen peroxide. 2 Previously, the hydrogen peroxide produced by lactobacilli was thought to inhibit pathogens associated with bacterial vaginosis, however the protective role of hydrogen peroxide is now controversial.

Accompanying the bacterial overgrowth in bacterial vaginosis is the increased production of amines by anaerobes, facilitated by microbial decarboxylases. Volatile amines in the presence of increased vaginal pH produce the typical fishy odor. Trimethylamine is the dominant abnormal amine in bacterial vaginosis. It is likely that bacterial polyamines together with the organic ac >Megasphaera spp. and Clostridial spp. BVAB I, II and III, offering new insights into pathogenesis. 3,4

Prevention

Since the pathogenesis of bacterial vaginosis is obscure, preventive measures have not been forthcoming. Because of the suspected role of sexual transmission, barrier contraception may reduce occurrence, and avoiding douching is recommended.

Clinical Features

As many as 50% of women with bacterial vaginosis may be asymptomatic. An abnormal malodorous vaginal discharge, often described as fishy, that is infrequently profuse and often appears after unprotected coitus and following menses, is usually described. Pruritus, dysuria and dyspareunia are rare. Examination reveals a nonviscous, grayish-white, adherent discharge.

Bacterial vaginosis has been incorrectly considered to be largely of nuisance value only. There is now considerable evidence of serious obstetric and gynecologic complications of bacterial vaginosis, including asymptomatic bacterial vaginosis diagnosed by Gram stain. Obstetric complications include chorioamnionitis, pre-term labor, prematurity and postpartum fever. 5 Gynecologic sequelae are post­abortion fever, posthysterectomy fever, cuff infection and chronic mast cell endometritis. An association is reported between untreated bacterial vaginosis and cervical inflammation and low-grade dysplasia. 6 Bacterial vaginosis is a risk factor for human immunodeficiency virus (HIV) acquisition and transmission. 7 Bacterial vaginosis is also a risk factor for acquisition of herpes simplex virus 2, gonorrhea and chlamydial infection. 8

Diagnosis

Signs and symptoms are unreliable in the diagnosis of bacterial vaginosis ( Table 53-2 ). The clinical diagnosis can reliably be made in the presence of at least three of the following Amsel objective criteria:

TABLE 53-2 . Diagnostic Features of Infectious Vaginitis

Normal Candida Vaginitis Bacterial Vaginosis Trichomonas Vaginitis
Symptoms None or physiologic leukorrhea Vulvar pruritus, soreness, increased discharge, dysuria, dyspareunia Malodorous moderate discharge Profuse purulent discharge, offensive odor, pruritus, and dyspareunia
Discharge
Amount Variable, scant to moderate Scant to moderate Moderate Profuse
Color Clear or white White White/gray Yellow
Consistency Floccular nonhomogeneous Clumped but variable Homogeneous, uniformly coating walls Homogeneous
‘Bubbles’ Absent Absent Present Present
Appearance of vulva and vagina Normal Introital and vulvar erythema, edema and occasional pustules, vaginal erythema No inflammation Erythema and swelling of vulvar and vaginal epithelium (strawberry cervix)
pH of vaginal fluid 4.7 5.0–6.0
Amine test (10% potassium hydroxide) Negative Negative Positive Occasionally present
Saline microscopy Normal epithelial cell, lactobacilli predominate Normal flora, blastospores (yeast) 40–50% pseudohyphae Clue cells, coccobacillary flora predominate, absence of leukocytes, motile curved rods PMNS +++, motile trichomonads (80–90%), no clue cells, abnormal flora
10% Potassium Hydroxide Microscopy Negative Positive (60–90%) Negative (except in mixed infections) Negative

adherent, white, nonfloccular homogeneous discharge

positive amine test, with release of fishy odor on addition of 10% potassium hydroxide to vaginal secretions

presence of clue cells on light microscopy.

The presence of clue cells is the single most reliable predictor of bacterial vaginosis. Clue cells are exfoliated vaginal squamous epithelial cells covered with G. vaginalis, giving the cells a granular or stippled appearance with characteristic loss of clear cell borders. Occasionally, clue cells covered exclusively by curved gram-negative rods belonging to Mobiluncus spp. can be demonstrated. Gram strain of vaginal secretions is extremely valuable in diagnosis, with a sensitivity of 93% and specificity of 70%, but uncommonly used except in the research setting.

Although cultures for G. vaginalis are positive in almost all cases of bacterial vaginosis, G. vaginalis may be detected in 50–60% of women who do not meet the diagnostic criteria for bacterial vaginosis. Accordingly, vaginal culture has no part in the diagnosis of bacterial vaginosis. DNA probes for G. vaginalis are both sensitive (95%) and moderately specific (95–99%), but are not widely used because of costs and lack of insurance reimbursement. Point-of-care diagnostic cards are available for rapid diagnosis, measuring pH, amines or sialidase; in addition, commercial tests using polymerase chain reaction (PCR) molecular technology are now widely available but are expensive.

Management

The most widely used therapy remains oral metronidazole or tinidazole. Most studies using multiple divided dose metronidazole regimens of 800–1200 mg/day for 1 week achieved clinical cure rates in excess of 90% immediately, and of approximately 80% at 4 weeks. Although single-dose therapy with 2 g metronidazole achieves comparable immediate clinical response rates, higher recurrence rates have been reported. The CDC-recommended regimen is metronidazole 500 mg twice-daily for 7 days. 9 The beneficial effect of metronidazole results predominantly from its anti-anaerobic activity and because G. vaginalis is susceptible to the hydroxymetabolites of metronidazole. Although Mycoplasma hominis and Mobiluncus curtisii are resistant to metronidazole, the organisms are usually not detected at follow-up visits of successfully treated patients. Metronidazole and tinidazole are considered therapeutic equivalents although tinidazole has fewer of the commonly experienced side effects.

Topical therapy with 2% clindamycin cream once daily for 7 days, clindamycin ovules for 3 days or metronidazole gel 0.75% administered daily for 5 days have been shown to be as effective as oral metronidazole, without any of the side effects of the latter. 9 Recently, metronidazole gel at higher concentration of 1.5% has become available but is of questionable advantage.

In the past, asymptomatic bacterial vaginosis was not treated, especially because some patients improve spontaneously over several months. However, the growing evidence linking asymptomatic bacterial vaginosis with numerous obstetric and gynecologic upper tract complications has caused reassessment of this policy, especially with additional convenient topical therapies. 5,10 Asymptomatic bacterial vaginosis should be treated before pregnancy, in women with cervical abnormalities and before elective gynecologic surgery. Routine screening for and treatment of asymptomatic bacterial vaginosis in pregnancy remains controversial, pending the outcome of studies proving that therapy of bacterial vaginosis reduces pre-term delivery and prematurity. 11

Despite indirect evidence of sexual transmission, no study has documented reduced recurrence rates of bacterial vaginosis in women whose partners have been treated with a variety of regimens, including metronidazole. Accordingly, most clinicians do not routinely treat male partners.

After therapy with oral metronidazole, approximately 30% of patients initially responding experience recurrence of symptoms within 3 months. 1 Reasons for recurrence are unclear, including the possibility of re-infection, but recurrence more likely reflects vaginal relapse, with failure to eradicate the offending organisms and re-establish the normal protective Lactobacillus spp. dominant vaginal flora. Management of bacterial vaginosis relapse includes oral or vaginal metronidazole, or topical clindamycin, usually prescribed for 14 days. Approaches including exogenous Lactobacillus spp. recolonization using selected bacteria-containing suppositories have been encouraging. Maintenance antimicrobial agents administered per vagina twice weekly for 4–6 months have been reasonably effective in controlling symptoms but cure is elusive. 12

Since being defined in 2011, CST-IV microbiota have been associated with a myriad of adverse clinical morbidities. In a series of molecular-based studies, CST-IV microbiota have been associated with T. vaginalis infection ( Brotman et al., 2012 ), vulvovaginal atrophy ( Brotman, Shardell, Gajer, Fadrosh, et al., 2014 ), high-risk HPV infection ( Dareng et al., 2015 ), a slow HPV remission rate ( Brotman, Shardell, Gajer, Tracy, et al., 2014 ) and increasing CIN severity (a precursor to invasive cervical cancer), regardless of HPV status ( Mitra et al., 2015 ). Women with CST-IV microbiota have reportedly higher IL-6 concentrations in cervical fluid (2- to 2.5-fold) and higher incidence of microbial invasion of the amniotic cavity, intraamniotic infection and histological chorioamnionitis ( Kacerovsky et al., 2015 ). Postmenopausal women predominantly have CST-IV microbiota ( Brotman, Shardell, Gajer, Fadrosh, et al., 2014 ), and among these women, this CST has been associated with signs of vulvovaginal atrophy. Specifically, women who were clinically diagnosed with mild or moderate vulvovaginal atrophy having 25-fold greater odds of being classified as CST-IV vs L. crispatus-dominant CST ( Brotman, Shardell, Gajer, Fadrosh, et al., 2014 ).

Фемофлор

Не так давно миру был представлен новый метод диагностики ПЦР — полимеразная цепная реакция. Он сразу обрел свою значимость, так как относительно других, ранее используемых видов диагностики, ПЦР позволяет качественно и количественно определить бактериальную или вирусную флору в биологических жидкостях человека.

Методика Фемофлор была представлена на международном конгрессе в 2010 году. Россия разработала свою методику в 2014 году, за что получила премию в номинации «Призвание». Сейчас этот метод включен в новые разработки диагностических этапов в практике «акушерства и гинекологии».

Что такое Фемофлор

Фемофлор — это методика определения качественного и количественного состава флоры влагалища, основанное на методике полимеразной цепной реакции. Он позволяет наблюдать за изменениями биоценоза в «режиме реального времени».

С помощью данного метода можно:

  • определить общую бактериальную массу слизистой влагалища;
  • выполнить точный забор материала для дальнейшего бак посева на микроскопический метод;
  • получить количественные показатели нормофлоры;
  • количественно и качественно оценить факультативную флору влагалища, произвести соотношение с нормофлорой.

Как уже было сказано, основой определения биоценоза влагалища с помощью Фемофлор является метод полимеразной цепной реакции с дальнейшей амплификацией генетического материала (размножение ДНК).

Данный процесс требует определенной последовательности:

  • расплетение волокон нуклеиновых кислот (ДНК);
  • присоединение праймеров (затравки) для образования новых нуклеиновых кислот;
  • достраивание новой цепочки ДНК по типу комплементарности.

То есть амплификация работает подобно клеточному ядру. Она находит ДНК микроорганизма и выстраивает новые идентичные цепи для усиления поиска и качественного определения. Это позволяет использовать минимальное количество исследуемого материала для обнаружения патогенных микроорганизмов. Но построение ДНК вне организма требует специальных условий, созданных искусственно в лаборатории.

Для проведения метода требуются определенные материалы:

  1. Матрица ДНК искомого микроорганизма;
  2. Пара комплементарных праймеров (затравки) — стоп-кодоны;
  3. ДНК-полимераза — необходима для активации реакции полимеризации (непосредственно амплификации);
  4. Комплементарные дезоксирибонуклеофосфаты — строительные компоненты для новых цепочек ДНК;
  5. Соли магния и буферный раствор — для максимальной схожести среды реакции, активации ферментативной активности.

Виды анализа

В разных лабораториях можно увидеть различные приставки к самому слову «Фемофлор». Есть Фемфлор 8 (9), Фемофлор Скрин, Фемофлор 4 и анализ Фемофлор 16 (17). По сути, это один и тот же метод, только включает дополнительные реактивы на другие микроорганизмы.

В таблице можно увидеть, какие именно микроорганизмы исследуют при том или ином наборе Фемофлор.

Рассмотрим подробнее каждого представителя:

  1. Lactobacillus spp. — это представители нормальной флоры. Палочки составляют около 90% флоры влагалища в здоровом организме женщины. Это грамположительные условно анаэробные представители микрофлоры, которые способны вырабатывать молочную кислоту. Последний компонент поддерживает кислую среду во влагалище, что является основным фактором местного иммунитета.
  2. Enterobacterium spp. — факультативные анаэробы, находятся в минимальном количестве в общей флоре, но тотальное размножение может стать причиной вагиноза.
  3. Streptococcus spp. — условно-патогенная микрофлора, аналогична кишечной палочке, представители факультативных анаэробов, грамположительные кокки.
  4. Staphylococcus spp. — факультативные анаэробы, также обладают грамположительными свойствами;
  5. Gardnerella vaginalis — патогенная флора, которая является наиболее частой причиной развития вагиноза. Относится к факультативным анаэробам.
  6. Eubacterium spp — бактериальные клетки, которые относятся к условно-патогенной флоре.
  7. Leptotrihia spp./Sneathia spp./Fusobacterium spp. — факультативная флора влагалища, относится к строгим анаэробам, обладает грамотрицательными свойствами.
  8. Veilonella spp./Megasphaera spp./Dialister spp. — строгие анаэробы, представители патогенных бактерий.
  9. Clostridium spp./Lachnobacterium spp. — грамположительные палочки, относятся к эндогенным анаэробам. Являются представители патогенной флоры, способные вызвать заболевание даже в небольшой концентрации. Опасность состоит в возможности бактерий образовывать споры.
  10. Mobyluncus spp./Corynebacterium spp. — грамположительные вибрионы, обладающие анаэробными свойствами.
  11. Peptostreptococcus spp. — грамположительные кокковидные факультативные анаэробы.
  12. Atopobium vaginae — его определение в крови или мазке из влагалища является маркерным знаком в обнаружении бактериального вагиноза. Это не значит, что именно он стал патогенным микроорганизмом. Палочка не имеет таких свойств. Его наличие свидетельствует о низком местном иммунитете и превалировании отличной от лактобацилл флоры.
  13. Mycoplasma genitalium+hominis — внутриклеточный паразитарный организм, который не имеет своей клеточной стенки. В норме данный представитель должен отсутствовать в организме женщины.
  14. Ureaplasma — в норме может обнаруживаться во влагалище, так как легко проникает из уретрального тракта в единичных количествах. Его жизнедеятельность не опасна для женщины в случае нормального состава биоценоза слизистой.
  15. Candida spp. — кандидоподобный гриб, любое ослабление местного и общего иммунитета часто сопровождается развитием вагинального кандидоза («молочницы»).

Фемофлор скрин отличается от вышеописанных анализов наличием других реактивов, способных за одно посещение к врачу исключить такие венерические заболевания, как гонорею, генитальный герпес, цитомегаловирус, трихомониаз, микоплазмоз и хламидиоз.

Показания к проведению

В связи со стоимостью процедуры провести такой анализ не каждому по карману. Поэтому врачи не разбрасываются направлениями направо и налево.

Конечно, сдать даже для профилактики такой анализ не помешает, но существуют определенные показания, которые просто требуют проведения Фемофлора:

  • подготовка к нормальной физиологической беременности;
  • планирование беременности с помощью экстракорпоральных методов оплодотворения;
  • каждый триместр беременности;
  • поэтапный контроль лечения дисбиоза;
  • оперативное вмешательство на органах малого таза;
  • диагностика самопроизвольных выкидышей и невозможность забеременеть;
  • патологические примеси и выделения из влагалища;
  • неприятный постоянный запах из влагалища;
  • зуд и жжение во влагалище и уретральном канале;
  • расстройства мочеиспускания;
  • появление новообразований и высыпаний на половых губах;
  • болезненность внизу живота;
  • болезненность или отсутствие менструаций.

Проведение анализа

Подготовка к анализу позволяет исключить ложные результаты. Поэтому стоит обратить внимание.

В случае запланированного анализа без наличия установленного воспалительного процесса необходимо учитывать день менструального цикла. Анализ нужно брать с пятого дня цикла, включая период до последних 5 дней перед началом месячных.

За несколько суток, не менее 48 часов до, следует исключить проведение каких-либо процедур диагностического и лечебного характера (кольпоскопия, вагинальный осмотр, биопсия), а также половой акт.

За сутки до взятия биоматериала следует ограничить спринцевания, введение вагинальных суппозиториев. В случае применения антибиотикотерапии желательно прекратить прием лекарств. Или проводить Фемофлор через неделю после окончания лечения.

Еще одним условием является исключение средств для интимной гигиены. Не стоит вымываться мылом или гелем, так как смывается вся флора, не только патогенная, но и постоянная. Результаты анализа будут неверными. Перед процедурой и за сутки до взятия материала рекомендуют подмыться чистой теплой водой.

За 2-3 часа до проведения Фемофлора нельзя ходить в туалет. Лучше подумать об этом заранее. После опорожнения тоже подмыться простой водой.

Непосредственно сама процедура занимает несколько минут. Гинеколог во время проведения общего гинекологического осмотра берет слизь со стенок влагалища в виде мазка.

Обязательно взятие материала должно быть произведено до мануального исследования. В случае загрязненности влагалища, просвет нужно очистить с помощью стерильного тампона или салфетки. Материал берут непосредственно с заднего свода зондом.

Потом зонд отправляется в пробирку с питательной средой. Материал отправляется в лабораторию на анализ.

Процесс выявления бактерий занимает 1-3 рабочих дня.

Расшифровка анализов

Первым условием является контроль забора материала. Его определяют по общему числу бактерий. Пригодным образцом считают материал с наличием не менее 10 4 геном-эквивалентов на один образец. При наличии необходимого количества последних, расшифровка продолжается.

Далее определяется общая бактериальная масса. Она должна быть в пределах 10 6 — 10 8 единиц на образец. Данный пункт показывает общую обсемененность бактериями влагалища.

Основным показателем являются лактобактерии. По соотношению к общей массе ставят «чистоту» влагалища. То есть степень риска развития вагиноза. В идеале, нормальная флора содержит 80-100% лактобактерий. Такой показатель свидетельствует о высоком местном иммунитете и уверенности, что вагиноза нет.

Другие цифры свидетельствуют о наличии дисбиоза и снижении иммунитета: 20-60% — умеренный дисбиоз; до 20% — выраженный дисбиоз.

Условно-патогенная флора может присутствовать, но не должна превышать количество. В норме они составляют менее 1% от общей массы. 1-10% свидетельствуют об умеренном дисбиозе, более 10% — ярко выраженный.

Патогенная флора, такая как микоплазмы, уреоплазмы и кандиды, должна отсутствовать. Даже обнаружение в минимальном количестве говорит о наличии инфекции.

Подготовка к анализу позволяет исключить ложные результаты. Поэтому стоит обратить внимание.

Штамм megasphaera elsdenii и его применение

Владельцы патента RU 2365621:

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве. Новый штамм Megasphaera elsdenii характеризуется способностью к утилизации лактата со степенью от 40% до 90% даже в присутствии сахаров. Штамм с указанной способностью получают способом, предусматривающим культивирование образца жидкости рубца. Новый штамм Megasphaera elsdenii используют в способе лечения и профилактики лактоацидоза у жвачных животных, в составе ветеринарного средства для лечения и профилактики указанного заболевания, в способе повышения молочной продуктивности и в способе повышения эффективности откорма жвачных животных, в способе повышения скорости роста и сокращения времени откорма жвачных животных, в способе снижения заболеваемости, обусловленной нарушениями пищеварения, и смертности среди жвачных животных от лактоацидоза, а также в способе улучшения эффективности конверсии рациона жвачного животного на основе концентрированных кормов при переводе жвачного животного на указанный рацион. Использование изобретения позволяет проводить широкомасштабное лечение и профилактику лактоацидоза. 12 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 18 табл.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение касается нового штамма Megasphaera elsdenii и его применения. Изобретение также касается препаратов и способов со включением этого штамма. Изобретение также касается кормов для жвачных животных и препарата и способа предупреждения и лечения лактоацидоза у жвачных животных.

Предшествующий уровень техники

Лактоацидоз — это расстройство пищеварения у жвачных животных, которое может возникнуть при внезапном чрезмерном потреблении легко ферментируемых углеводов, в частности, при переходе от грубых кормов на высококалорийные или калорийные концентраты с высоким содержанием крахмала. Заболевание характеризуется накоплением органических кислот, особенно молочной кислоты, в рубце (Dawson & Allison, 1988). Исследования показали, что основной причиной возникновения лактоацидоза является сильный дисбаланс между количеством бактерий, продуцирующих молочную кислоту, и бактерий, утилизирующих молочную кислоту, который возникает при внезапном увеличении доли легко ферментируемых углеводов в пище (Slyter, 1976).

Способы контроля над популяцией бактерий в рубце для предупреждения лактоацидоза путем введения материала, содержащего большое количество утилизирующих молочную кислоту бактерий, предлагались в течение десятилетий, но никогда не практиковались в широком масштабе. Повышение утилизации лактата в рубце осуществляли введением жидкости из рубца заранее адаптированных животных (Allison et al., 1964; Braun et al., 1992) и введением чистых или смешанных штаммов бактерий, утилизирующих лактат (1251483, Wilker et al., 1971; 3857971, Abdo & Cahilly, 1974; 4138498, Das, 1979; 5380525, Leedle et al., 1991; Hession & Kung, 1992; Robinson et al, 1992; Wiryawan & Brooker, 1995).

Некоторые из таких кормовых добавок, содержащих штаммы живых бактерий, были запатентованы (1251483, Wilker et al., 1971; 3857971, Abdo & Cahilly, 1974; 4138498, Das, 1979; 5380525, Leedle et al., 1991), но совсем или почти совсем не нашли коммерческого применения. В трех из этих патентов (1251483, Wilker et al., 1971; 3857971, Abdo & Cahilly, 1974; 4138498, Das, 1979) культуры получали в ферментерах для непрерывного культивирования при исходной инокуляции их рубцовой жидкостью. Однако животные-доноры не обязательно были адаптированы к рациону с высоким содержанием концентратов. К тому же нет сведений о pH-толерантности этих культур. В другом патенте (5 380 525, Leedle et al., 1991) культуры были выделены при pH 5,3 прямо или косвенно после обогащения из жвачных животных, адаптированных к рациону с высоким содержанием концентратов.

Встречаемость подострого и острого ацидоза у молочного скота

Подострый ацидоз рубца является распространенной и серьезной проблемой здравоохранения и производства в молочной промышленности, так как молочных коров обычно кормят кормами, содержащими большую долю зерновых. Подострый и острый ацидоз рубца представляют собой просто разные степени одной и той же проблемы. Острый ацидоз рубца протекает в более тяжелой форме, и могут быть серьезно нарушены физиологические функции. Заболевшее животное депрессивно, обычно атаксично, не принимает корм, зрачки расширены и сердцебиение учащено. Может возникнуть понос, животное может упасть и умереть в течение 2-5 дней после поражения (Nordlund, 1995). Острый ацидоз характеризуется резким уменьшением pH в рубце (≤5,0), сильным повышением концентрации молочной кислоты и сильным уменьшением количества протозойных организмов (Nocek, 1997).

Симптомы подострого ацидоза рубца весьма отличаются от симптомов острого ацидоза. Современные хозяйственные системы группового содержания и группового кормления молочного скота затрудняют выявление этих симптомов, так как отдельные коровы с такими проблемами обычно не заметны внутри группы. В стадах с подострым ацидозом рубца проявляются некоторые или все из следующих симптомов: ламинит, перемежающийся понос, плохой аппетит или циклический прием корма, высокие показатели отбраковки в стаде по нечетко определяемым проблемам здоровья, плохое состояние организма, несмотря на адекватное потребление энергии, абсцессы без видимых причин и гемоптизис (кашель кровью) или эпистаксиз (кровотечение из носа). Большинство из этих симптомов являются вторичными вследствие ацидоза и большинство из них не проявляются в течение недель или месяцев после начала ацидоза. В отличие от мясного (откармливаемого) скота, молочные коровы содержатся в течение ряда лет, поэтому контроль над ацидозом представляется важным для увеличения прибыли.

Хронический ламинит, по-видимому, является самым устойчивым клиническим признаком в стаде с подострым ацидозом рубца. Несмотря на то, что взаимосвязь между ацидозом и ламинитом не совсем понятна, она общепризнанна клинически и продемонстрирована в исследовательских опытах (Kelly & Leaver, 1990; Manson & Leaver, 1988; Nocek, 1997). Кроме того, большинство хозяйственников, ветеринаров и специалистов по питанию имеют склонность недооценивать и даже терпимо относиться к аномальной встречаемости ламинита и хромоты в стадах молочных коров. Обследование в Миннесоте показало, что средняя частота хромоты составляет 15% с диапазоном 0-33% (Nordlund, Garret & Oetzel, 1995). Исследования в Европе показали, что хромота стоит на третьем месте по затратам на лечение у молочных коров после мастита и репродукции (McDaniel & Wilk, 1989). Таким образом, лечение ацидоза имеет огромную важность.

Главным симптомом подострого ацидоза является снижение потребления корма и снижение эффективности выработки молока. Подострый ацидоз, вследствие трудностей в его диагностике, обычно игнорируют, поскольку другие проблемы, такие как плохое ведение хозяйства, плохое качество корма и т.д. вызывают большие убытки у многих фермеров, поэтому он вездесущ, особенно в высокопродуктивных молочных стадах.

Вследствие высокой частоты алиментарных и метаболических нарушений среди высокопродуктивных молочных коров, алиментарные подходы к улучшению производительности с помощью кормов на основе зерновых сосредоточены на предупреждении дисфункции рубца путем контролирования продукции кислоты или стимулирования более эффективного роста микроорганизмов. В настоящее время важную роль в этом отношении играют кормовые добавки (Hutjens, 1999). Применение культуральных штаммов дрожжей, специфически стимулирующих рост бактерий, утилизирующих молочную кислоту, вызывает большой интерес, и недавнее обследование показало, что дрожжевые культуры применяются в 33% высокопродуктивных стад Висконсина. Результаты различных исследований свидетельствуют, что штамм Yea Sacc 84170 особенно хорошо подходит для изменения ферментации в рубце и продуктивности животных, когда он применяется в силосе с высоким уровнем лактата и в кормах с высоким содержанием питательных веществ (Dawson, 1995). Результаты по продуктивности, однако, не очень устойчивы. В США стоимость добавления дрожжевых культур составляет 4-6 центов на корову в день (Hutjens, 1999). Ионофоры, вследствие их способности к предотвращению роста важных продуцентов молочной кислоты, также могут играть роль в борьбе с подострым ацидозом. Хотя их стоимость сравнительно низкая (1-2 цента на корову в день, Hutjens, 1999), существует определенное сопротивление применению ионофоров из-за нескольких недавних случаев токсичности ионофоров. Кроме того, ионофоры не зарегистрированы в США для применения в кормах для молочного скота.

Экспериментальным путем установлено, что некоторые бактерии перспективны в качестве непосредственно скармливаемых микроорганизмов (DFM) для жвачных животных, но они не нашли коммерческого применения по нескольким причинам. Например, Megasphaera elsdenii (ME) является основным утилизирующим лактат организмом в рубце адаптированного скота, потребляющего корма с высоким содержанием зерна. При переходе от фуража на рацион с высоким содержанием концентратов количество ME зачастую недостаточно для предотвращения лактоацидоза. Kung and Hessian (1995) показали, что добавление ME штамма В 159 предотвращает накопление молочной кислоты при скармливании хорошо сбраживаемых углеводов. Robinson et al. (1992) показали, что добавление другого штамма ME (407А) предотвращает лактоацидоз у кастрированных бычков.

Несмотря на то, что затраты, связанные с субклиническим ацидозом рубца, трудно определить, возможные затраты в молочной промышленности огромны (Hall, 1999). По консервативной оценке Donovan (1997), затраты при субклиническом ацидозе в молочной промышленности США составляют от 500 млн. до 1 трлн. долларов в год.

Elsden and Lewis (1953) впервые описали большого, строго анаэробного, грам-отрицательного, продуцирующего жирные кислоты неподвижного кокка, выделенного из рубца овец. Однако первоначальный изолят был утерян и не был подробно охарактеризован фенотипически. Через несколько лет Элсден и сотр. (Elsden et al., 1956) выделили организм, напоминающий первоначальный штамм, из содержимого рубца овец. Характеристики этого организма не совпадали с описанием ни одного известного в то время вида, но ввиду небольшого изученного числа изолятов авторы воздержались от отнесения его к новому виду и роду, а называли его LC. Gutierrez et al. (1959) встретили похожий организм в рубцах вздувшегося скота и сделали вывод, что он соответствует определению рода Peptostreptococcus, предложив учредить новый вид P.elsdenii. Впоследствии Rogosa (1971) показал, что изоляты типа LC грам-отрицательны и поэтому не должны включаться в род Peptostreptococcus. Он предложил перенести P.elsdenii в новый род Megasphaera и новую комбинацию M.elsdenii, с изолятом LC1 согласно Elsden et al. (1956) в качестве типового штамма. M.elsdenii является строгим анаэробом, который встречается главным образом в рубце молодых животных и животных, получающих корма с высоким содержанием концентратов, у которых сбраживание лактата сильно выражено. Этот организм также иногда выделяли из кала человека (Sugihara et al., 1974), причем он сбраживает лактат в основном до бутирата, пропионата, изобутирата, валерата, CO2, H2 и иногда следовых количеств капроата (Stewart and Bryant, 1988). Поскольку микроорганизм M.elsdenii не подвержен катаболитной репрессии глюкозой или мальтозой, как Selenomonas, который тоже утилизирует лактат и встречается в рубце, то его вклад в катаболизм лактата особенно повышается при скармливании растворимых углеводов (Stewart and Bryant, 1988).

В патенте США 3956482 (Hahn et al., 1976) описан способ повышения продукции молока у жвачных животных, включающий введение в рубец дойных коров микроорганизмов, продуцирующих ацетат, состоящих из смеси 0-4% M.elsdenii, 30-42% Streptococcus bovis, 3-10% Lactobacillus acidophilus, 12-20% Bifidobacterium adolescentis, 18-44% Bacteroides ruminicola и 3-12% Butyrivibrio fibrisolvens, культивируемых и адаптированных к питательной среде.

Основным недостатком изобретения, раскрытого в вышеуказанном патенте, является сравнительно высокое содержание (30-42%) Streptococcus bovis, который вместе с Lactobacillus является главной причиной лактоацидоза у жвачных. Кроме того, эта смесь содержит сравнительно мало M.elsdenii (0-4%), и введение этой смеси скорее будет усиливать или вызывать лактоацидоз рубца, а не предотвращать или излечивать его. Более того, смесь подвергается воздействию атмосферы, так что большая часть M.elsdenii погибает. Кроме того, смесь микроорганизмов значительно труднее контролировать, чем чистую культуру.

В патенте США 4138498 (Das, 1979) описана кормовая добавка для введения жвачным животным для предупреждения или минимизации лактоацидоза при переводе их с грубого корма на крахмал, которая включает штамм бактерий M.elsdenii в смеси с поедаемой кормовой добавкой. M.elsdenii — строгий анаэроб, поэтому недостатком кормовой добавки, раскрытой в этом патенте, в добавление к недостаткам, изложенным ниже, является то, что M.elsdenii подвергается воздействию атмосферы, что ведет к быстрому снижению числа жизнеспособных клеток в добавке.

В патенте США 5380525 (Leedle et al., 1991) описана биологически чистая культура M.elsdenii NRRL-18624 и ее применение в облегчении адаптации жвачных животных от грубого корма или подножного корма к высококалорийному корму, обогащенному крахмалом. Эта культура страдает недостатками, изложенными ниже.

В патенте США 5529793 (Garner et al., 1996) описана смесь из бактерий, продуцирующих молочную кислоту, и бактерий, утилизирующих лактат, типа M.elsdenii в составе сухой смеси или в рационе откорма животных для улучшения утилизации корма жвачными животными. Недостатком этого изобретения является то, что M.elsdenii -весьма строгий анаэроб, поэтому ее применение в сухом корме приводит к гибели большинства клеток.

Заявители провели оценку вышеуказанных штаммов M.elsdenii и пришли к выводу, что они, в общем-то, не подходят для коммерческого применения и широкомасштабной профилактики лактоацидоза у жвачных животных вследствие следующих недостатков этих штаммов, а именно того, что они:

— не высокоактивны и не адаптированы к пролиферации в рубце животных на рационе с высоким содержанием концентратов;

— не способны к пролиферации при относительно низких значениях pH менее 5,0 и даже 4,5, что определяется как острый ацидоз;

— не устойчивы к антибиотикам-ионофорам, обычно добавляемым в рацион откорма;

— не способны к предпочтительному использованию лактата в качестве источника углерода даже в присутствии растворимых углеводов, таких как глюкоза и мальтоза.

Другие недостатки этих штаммов состоят в том, что они, в общем:

— имеют сравнительно низкую скорость роста, т.е. менее 0,938 ч -1 ;

— не обладают способностью к росту на восстанавливающих сахарах, а также на лактате;

— имеют сравнительно низкую скорость накопления биомассы, т.е. менее 0,39 г(л×час) -1 ;

— не устойчивы к ионофорам;

— преимущественно продуцируют пропионат и бутират, а не ацетат.

Таким образом, целью настоящего изобретения является получение новых штаммов M.elsdenii и их применение, а также препараты и способы на основе выделенных штаммов, с помощью которых вышеуказанные недостатки могут быть преодолены или по крайней мере минимизированы.

В соответствии с первым аспектом изобретения предоставляется штамм M.elsdenii (изолят CH4), депонированного в NCIMB, Aberdeen, Scotland, UK под номером NCIMB 41125.

В соответствии со вторым аспектом изобретения предоставляется штамм M.elsdenii, имеющих практически такую же последовательность рибосомальной 16S РНК, как у штамма M.elsdenii, депонированного в NCIMB, Aberdeen, Scotland, UK под номером NCIMB 41125.

Штамм M.elsdenii по первому и второму аспектам изобретения дополнительно характеризуется:

— способностью к утилизации лактата весьма эффективно даже в присутствии сахаров;

— устойчивостью к ионофорам;

— относительно высокой скоростью роста;

— способностью к преимущественной продукции ацетата и

— способностью к пролиферации при сравнительно низких значениях pH менее 5,0 и даже 4,5.

В соответствии с третьим аспектом изобретения предоставляется композиция для облегчения адаптации жвачных животных от рациона на основе грубого корма к высококалорийному рациону на основе концентратов, причем композиция в основном состоит из штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения.

В соответствии с четвертым аспектом изобретения предоставляется способ облегчения адаптации жвачных животных от рациона на основе грубого корма к высококалорийному рациону на основе концентратов, который включает стадию введения в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения.

В соответствии с пятым аспектом изобретения предоставляется кормовая добавка для жвачных животных, включающая носитель и эффективное количество штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения.

Предпочтительно культура размещается в анаэробном контейнере.

В соответствии с шестым аспектом изобретения предоставляется способ лечения лактоацидоза рубца и предупреждения одного или нескольких из следующего, а именно: лактоацидоза рубца, руменита, ламинита, вызванного лактоацидозом рубца, вздутия живота и абсцессов печени, вызванных лактоацидозом рубца, который включает стадию анаэробного введения в рубец жвачного животного эффективного количества штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения.

В соответствии с седьмым аспектом изобретения предоставляется ветеринарное средство для лечения лактоацидоза рубца и предупреждения одного или нескольких из следующего, а именно: лактоацидоза рубца, руменита, ламинита, вызванного лактоацидозом рубца, вздутия живота и абсцессов печени, вызванных лактоацидозом рубца, которое включает эффективное количество штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения.

В соответствии с восьмым аспектом изобретения предоставляется препарат для лечения лактоацидоза рубца и предупреждения одного или нескольких из следующего, а именно: лактоацидоза рубца, руменита, ламинита, вызванного лактоацидозом рубца, вздутия живота и абсцессов печени, вызванных лактоацидозом рубца, у жвачных животных, который включает:

— инокулят штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения и

— отдельную среду для анаэробного культивирования;

причем компоненты препарата размещаются в отдельных отсеках анаэробного контейнера, которые анаэробно соединяются друг с другом таким образом, чтобы можно было анаэробно инокулировать среду этой культурой.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предоставляется способ достижения одного или нескольких из следующих улучшений у жвачных животных, а именно:

— повышения продукции молока;

— повышения эффективности откорма;

— увеличения скорости роста;

— сокращения времени откорма;

— снижения заболеваемости и смертности от нарушений пищеварения;

— уменьшения числа случаев лактоацидоза и связанных с этим заболеваний;

— улучшения эффективности переработки корма и

— способности к питанию на рационе со сравнительно высоким содержанием концентратов;

который включает стадию введения в рубец жвачного животного эффективного количества штамма бактерий по первому или второму аспекту изобретения. Предпочтительно культура вводится анаэробно.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предоставляется способ выделения биологически чистой культуры более ценного микроорганизма рубца за сравнительно более короткий промежуток времени, чем у стандартных способов, который включает стадии:

— получения образца рубцовой жидкости и

— культивирования образца на заданной питательной среде;

причем способ отличается тем, что предварительно выбирают несколько параметров, выбранных из группы, включающей состав питательной среды, степень разбавления, pH, температуру, противомикробные средства, газовую среду, окислительно-восстановительный потенциал, нехватку питательных веществ и провоцирующие организмы, таким образом, чтобы они благоприятствовали более ценному микроорганизму рубца в ущерб менее ценным микроорганизмам рубца.

Далее изобретение будет описано более подробно на нижеследующих примерах и прилагаемых чертежах.

Краткое описание фигур

Фиг.1. График скорости роста утилизирующих лактат организмов при различных значениях pH.

Фиг.2. График скорости роста (ч -1 ) утилизирующих лактат изолятов на глюкозной среде при различных значениях pH.

Фиг.3. Филогенетическое древо M.elsdenii по настоящему изобретению.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В соответствии с настоящим изобретением организмы, способные к утилизации молочной кислоты, выделяли непосредственно из жвачных животных, адаптированных к рациону с высоким содержанием концентратов. Цель заключалась в отборе культур, обладающих наилучшей комбинацией характеристик для применения в качестве инокулята, поддающегося массовому культивированию и хранению, для профилактического и/или терапевтического лечения лактоацидоза.

Для того чтобы утилизирующие лактат бактерии были эффективными, они должны быть высокоактивными и адаптированными к размножению в рубце животных на рационе с высоким содержанием концентратов. Организмы должны быть способны к размножению при значениях pH ниже 5,0. Отобранные изоляты также должны быть устойчивыми к антибиотикам-ионофорам, которые обычно добавляют в рацион откорма. Лактат должен использоваться преимущественно в качестве источника углерода даже в присутствии растворимых углеводов, таких как глюкоза и мальтоза, которые обычно находятся в большом количестве в кормах с высоким содержанием концентратов.

1. Животные, использовавшиеся при выделении

Брали образцы содержимого из рубца животных, прошедших предварительный отбор на утилизирующие лактат бактерии, а именно: дойных коров с фистулами в Отделе питания дойных коров Совета по сельскохозяйственным исследованиям (Irene, Южная Африка), а также мясного скота Chalmar Beef (Претория, Южная Африка), которых забивали по окончании периода откорма. Все животные были адаптированы к рациону с высоким содержанием концентратов, что повышает количество встречающихся естественным образом бактерий, утилизирующих лактат.

2. Отбор и подготовка образцов

Образцы содержимого рубца из дойных коров отбирали примерно в 9:00, после того, как коров покормили и подоили. Образцы содержимого рубца мясных животных получали через 15-30 мин после забоя животных. Пластиковые флаконы с винтовыми крышками заполняли до отказа рубцовой жидкостью, профильтрованной через два слоя марли. Рубцовую жидкость переносили прямо в ферментер.

Система для проточного культивирования Bioflo 1 фирмы New Brunswick Scientific была модифицирована в pH-ауксостат путем превращения поддерживающего pH насоса в насос для подачи среды. Величину pH измеряли с помощью pH-электрода Schott S23158, подсоединенного к pH-метру и титратору модели 302 фирмы Digital Data Systems. Когда pH повышался выше заданного значения, добавляли слабо забуференную среду до достижения требуемого значения. Рабочий объем сосуда для культивирования составлял 270 мл. Максимальная степень разбавления для данного организма при культивировании в ауксостате является мерой максимальной скорости роста этого организма при этих условиях.

4. Выделение утилизирующих лактат бактерий рубца при помощи ауксостата

4.1 Условия культивирования и среда

Профильтрованную рубцовую жидкость использовали для начального заполнения ферментера (270 мл) и активировали титратор для добавления стерильной среды (среда 1) в культуру пропорционально повышению pH культуры. Среда 1 представляла собой среду частично определенного состава без рубцовой жидкости, содержащую: Na-лактат (70%), 10 г/л; пептон, 2 г/л; KH2PO4, 1 г/л; (NH4)2SO4, 3 г/л; MgSO4·7H2O, 0,2 г/л; CaCl2·2H2O, 0,06 г/л; витамины (пиридоксогидрохлорид, 4 мг/л; пиридоксамин, 4 мг/л, рибофлавин, 4 мг/л, тиаминохлорид, 4 мг/л, никотинамид, 4 мг/л; D-пантотенат кальция, 4 мг/л; 4-аминобензойная кислота, 0,2 мг/л; биотин, 0,2 мг/л; фолиевая кислота, 0,1 мг/л; цианокобаламин, 0,02 мг/л); Na2S·9H2O, 0,25 г/л; цистеин, 0,25 г/л; противопенная добавка, 0,07 мл/л и монензин, 10 мг/л. Na-лактат и раствор минералов вносили в бачок титратора и автоклавировали в течение 60 мин. Пептон растворяли в 300 мл дист. H2O и автоклавировали отдельно в колбе на 1,0 л фирмы Schott с отводом на дне, снабженным стеклянным патрубком Quick-fit. Раствор витаминов стерилизовали фильтрованием перед употреблением, как и оба восстановителя. После автоклавирования через бачок титратора пропускали анаэробный газ в течение ночи и добавляли остальные компоненты по отдельности после охлаждения. Величину pH доводили до требуемого значения с помощью 5N HCl.

Запускали проточное культивирование до тех пор, пока не наблюдалась чистая культура под микроскопом. Отбирали образец из ферментера стерильным шприцом, который герметично закрывали и переносили в анаэробный кабинет (Forma Scientific, модель 1024). Одну каплю культуры штриховали на чашке Петри, содержащей 2% агар на среде 1. Затем инкубировали при 39°С в течение ночи и переносили одиночную колонию с помощью стерильной иглы и шприца в свежую среду 1, находящуюся во флаконе на 30 мл. После инкубации при 39°С в течение 24 ч культуру переносили на несколько косячков, содержащих среду 1, и инкубировали в течение ночи. Эти косячки хранили в жидком азоте для долговременного хранения.

4.2 Скорость роста изолятов в замкнутом объеме ферментера

Скорость роста изолятов проверяли методом культивирования в замкнутом объеме и измерения повышения оптической плотности по времени. Наносили на график значения натурального логарифма оптической плотности (OD) в зависимости от времени и использовали линейную часть графика для определения наклона, который представляет максимальную скорость роста организма. Определение скорости роста в замкнутом объеме проводили в хемостате на культуре, которую разводили стерильной средой до получения сильно разведенной суспензии культуры, и прекращали подачу среды, запуская культивирование в замкнутом объеме. Преимущество культивирования в хемостате для данной работы заключается в отсутствии лаг-фазы, поскольку все клетки жизнеспособны и адаптированы к этой среде.

4.3 Аналитические методы

Летучие жирные кислоты определяли методом газовой хроматографии на газовом хроматографе Carlo Erba GC4200 с пламенным детектором и колонкой Tupelo 1-1825 (Supelco Inc., Bellefonte PA, США). Рабочие условия: газ-носитель — азот, газы пламени — водород и воздух, температура колонки — 175°С, температура инжектора — 200°С. Для интегрирования пиков использовали систему обработки данных Barspec (Barspec Systems Inc., Rehovot, Israel). В качестве внутреннего стандарта служила пивалиновая кислота. Утилизация D- и L-изомеров лактата определяли энзиматически (набор Test combination 1112 821, Boehringer Mannheim Gmbh, Mannheim).

5. Выделение бактерий методом рассева на чашках

5.1 Культуральная среда

Лактатная среда с инкубированной рубцовой жидкостью (IRFL) для выделения методом рассева на чашках состояла из 400 мл инкубированной осветленной рубцовой жидкости (Olumeyan et al., 1986) из питавшихся люцерной овец, 371 мл дистиллированной воды, 2 г пептона (Merck), 15 г агара, 100 мл 10% раствора D,L-лактата натрия, 100 мл 0,04% раствора бромокрезола пурпурного и 25 мл раствора минералов, содержащего 40 г/л KH2PO4, 120 г/л (NH4)2SO4, 8 г/л MgSO4·7H2O и 2,4 г/л CaCl2·2H2O. Молочную кислоту (90% мас./объем) использовали для доведения pH до 5,5 перед автоклавированием при 121°С в течение 25 мин. После стерилизации среду охлаждали в водяной бане на 50°С с пропусканием анаэробной газовой смеси. Асептически добавляли по 2 мл каждого из восстановителей: Na2S·9H2O (12,5% мас./объем) и цистеина·HCl·H2O (12,5% мас./объем). Поскольку среда IRFL не вполне селективна для утилизирующих лактат бактерий, включали бромокрезол пурпурный для лучшего их выявления. При утилизации лактата происходит изменение ионного баланса в непосредственной близости от колонии, что вызывает повышение pH. Повышение pH свыше 6,3 проявляется как изменение окраски из желтой в пурпурную в концентрической зоне культуры.

Кислотоустойчивость определяли на чашках с IRFL-агаром при исходных значениях pH 4,4, 5,0 и 5,5.

Устойчивость к ионофорам тестировали на чашках с IRFL-агаром, содержащим 10 ppm ионофоров, обычно применяемых в кормах с высоким содержанием концентратов, а именно: монензина (Sigma) и лазалоцида (Sigma). Репрессию утилизации лактата растворимыми сахарами тестировали на чашках с IRFL-агаром, содержащим мальтозу или глюкозу в конечной концентрации 10 г/л. Положительный результат, т.е. пурпурная концентрическая зона вокруг колонии указывает на то, что скорость выделения оснований вследствие утилизации лактата превосходит скорость образования кислот из добавленного сахара. Изоляты также скринировали на агаризованной среде IRFL без лактата, но с добавлением мальтозы или глюкозы в концентрации 10 г/л для определения утилизации этих двух сахаров.

Скорость роста на мальтозе и глюкозе определяли на средах, аналогичных среде SDL, но в которых лактат был заменен глюкозой или мальтозой в концентрации 10 г/л.

5.2 Выделение и скринирование методом рассева на чашках

Образцы для выделения методом рассева на чашках разводили (Mackie & Heath, 1979) в анаэробном кабинете. Готовили чашки для рассева со средой IRFL с разведениями от 10 -4 до 10 -6 и инкубировали анаэробно при 39°С. Через 24 часа отдельные колонии с пурпурной зоной переносили в жидкую среду IRFL в микропробирках на 1,5 мл. Инокулированные микропробирки, проявлявшие изменение окраски на пурпурную в пределах 16 часов, скринировали на кислотостойкость, устойчивость к ионофорам, репрессию катаболитами и утилизацию глюкозы и/или мальтозы. Скринирование проводили методом перепечатывания (Lederberger & Lederberger, 1952) с помощью многоточечной иглы для посева, инокулируя 20 изолятов на комплект из 9 агаровых чашек различного состава, описанного выше.

5.3 Определение скорости роста

Рост измеряли, в тройном повторе, в среде SDL, SDG или SDM по повышению мутности при 578 нм. Между измерениями флаконы инкубировали на водяной бане при 39°С. Измерения продолжали до тех пор, пока мутность не достигала предела при удовлетворительном соотношении с биомассой. Наносили на график натуральные логарифмы оптической плотности (OD) в зависимости от времени инкубации. Наклон в экспоненциальной фазе роста, представляющий удельную скорость роста, рассчитывали методом линейной регрессии с помощью пакета программ для табличных вычислений.

После этого культуры, культивируемые на среде SDL при pH 5,7, инкубировали еще 24 часа, а затем отбирали 9 мл на хранение добавлением 1 мл 10% (мас./объем) NaOH для анализа образовавшихся конечных продуктов и утилизации изомеров лактата.

5.4 Физиологическое исследование роста изолятов из чашек

Описание ферментера. Запускали проточную систему культивирования с тремя ферментерами емкостью примерно по 250 мл каждый. Использовали один и тот же перистальтический насос для подачи среды с различной скоростью в три ферментера. Температуру культур поддерживали при 39°С. Через среду и ферментеры пропускали 100% CO2 для поддержания анаэробных условий. Значение pH культур поддерживали при pH 5,5 добавлением 20% ортофосфорной кислоты по мере необходимости. Степень разбавления устанавливали на 70%, 80% и 90% от максимальной скорости роста. Из каждого ферментера в стационарном состоянии отбирали асептически образец в 80 мл. По этому образцу определяли сухую массу клеток и остаточную молочную кислоту в среде. Скорость накопления биомассы как произведение степени разбавления и биомассы в стационарном состоянии рассчитывали по действительным значениям степени разбавления и сухой массы. Коэффициент выхода биомассы, являющийся функцией концентрации биомассы в стационарном состоянии от количества утилизированного субстрата, рассчитывали по значениям остаточной молочной кислоты и сухой массы.

6. Опыты на овцах для оценки способности изолята CH4 к предотвращению накопления молочной кислоты в рубце

В первом опыте 12 кастрированных баранов с катетером в рубце (средний живой вес около 40 кг) разбивали по случайной схеме на опытную и контрольную группы, каждая из которых состояла из 6 животных. Всех животных кормили неограниченно грубыми кормами 21 день. На 21-й день они голодали 11 часов, после чего им давали по 1000 г кукурузного корма и в то же время вводили непосредственно в рубец по 300 г мальтозного сиропа. Через 1 час всю не потребленную животным кукурузу вводили непосредственно в рубец. Сразу после этого животным опытной группы вводили в рубец 1×10 11 к.о.е. CH4, тогда как животным контрольной группы вводили такое же количество бесклеточного фильтрата из препарата CH4, т.е. без CH4. Для определения концентрации молочной кислоты в рубце через каждые 2 часа отбирали пробы жидкости из рубца на протяжении 12 часов после введения дозы.

Во втором опыте исследовали другую группу из 12 кастрированных ягнят с катетером в рубце (средний живой вес 29 кг) без предварительного кормления концентратом. Они имели свободный доступ к измельченному сену из Eragrostis teff и белково-минеральной смеси. Ягнят разбивали по случайной схеме на две группы по 6 животных, то есть опытную и контрольную группы. В первый день эксперимента (день 1) все животные получали в неограниченном количестве следующий рацион: кукуруза, 888; меласса, 69; мочевина, 17; известняк, 11; дикальцийфосфат, 6; соль, 4; сульфат аммония, 4; минерально-витаминный премикс с монензином, 1 (г/кг с.в.). В первый день перехода на концентрат каждому животному опытной группы вводили в рубец дозу СН4 в 12:00, т.е. через 3 часа после кормления. Животным контрольной группы вводили такое же количество воды. Для определения концентрации молочной кислоты пробы из рубца отбирали в различное время накануне перехода на концентрат (день -1) и на 1-й, 2-й, 3-й и 7-й день после перехода на концентрат.

7. Оценка изолята СН4 на высокопродуктивных молочных коровах

7.1 Культивирование утилизирующих лактат организмов для опыта на животных

Ферментер Braun Biostat В с рабочим объемом в 10 л был переоборудован в хемостат с помощью дозирующего насоса Watson-Marlow 505S, снабженного приводом на 55 об/мин, для подачи стерильной среды из 50-ти литровых бочек из нержавеющей стали. Рабочий объем поддерживали на постоянном уровне путем непрерывной подачи избытка культуры из ферментера при превышении уровня в 10 л через погруженную трубку с помощью перистальтического насоса (Watson-Marlow 505S) в полипропиленовую 50-ти литровую бутыль, стоящую в холодильной камере. Производительность этого собирающего насоса составляла приблизительно 120% относительно подающего среду насоса. Избыточный объем, выводимый из ферментера, состоял из анаэробного газа, поступающего из свободного пространства над средой.

Для концентрирования культуры использовали тангенциальную систему фильтрации (Millipore Pellicon), снабженную фильтром Millipore HVMP на 0,45 мкм (15 кв. футов) и перистальтическим насосом Millipore Masterflex Easy-Load.

Для культивирования использовали среду CSL4. Растворы витаминов, восстановителей, минералов и микроэлементов стерилизовали фильтрованием перед добавлением в емкость со средой. После автоклавирования емкость заполняли анаэробным газом.

Производственный процесс был организован по скользящему графику. Были осуществлены два цикла продукции, каждый из которых давал достаточно клеток для введения группе животных на 1 день. Количество стадий концентрирования было ограничено одной, поскольку ежедневно получаемый продукт собирали в 50-литровую емкость. Коэффициент разбавления составлял 0,4 час -1 , а «простой» между партиями составлял 50 мин. Перед первым днем производства запускали резервный цикл на 45 литров, который также способствовал переходу культуры в хемостате в стационарное состояние.

7.2 Экспериментальные животные

Шестьдесят высокопродуктивных молочных коров разбивали на группы в соответствии с продукцией молока во время предыдущей лактации и весом тела, после чего внутри каждой группы по случайной схеме проводили один из следующих экспериментов: 1) контрольный рацион, содержащий 60% концентратов; 2) контрольный рацион, содержащий 60% концентратов +СН4; 3) контрольный рацион, содержащий 70% концентратов; 4) контрольный рацион, содержащий 70% концентратов +СН4. Коровам вводили дозу организма СН4 при отеле, через 10 дней и через 20 дней после отела.

Регистрировали следующие параметры:

1) суточное потребление сухих веществ;

2) суточную продукцию молока;

3) содержание жира, белка и лактозы в молоке еженедельно и

4) вес тела и общее состояние в баллах ежемесячно.

8. Статистический анализ

Данные анализировали при помощи дисперсионного анализа для полностью случайной разбивки на группы, используя программу Genstat 5. Данные по продукции молока при последней лактации использовали в качестве ковариантного контроля, а продукцию молока выражали по сравнению с этим контролем. Для определения значимых отличий при различных воздействиях сравнивали результаты следующих парных опытов:

— +CH4 или -CH4 (введение дозы или отсутствие дозы)

— Контрольный рацион, состоящий из 70% концентратов, против контрольного рациона, состоящего из 70% концентратов +CH4.

— Контрольный рацион, состоящий из 60% концентратов, против контрольного рациона, состоящего из 60% концентратов +CH4.

Различия считали значимыми при p а Последовательность праймера (5′-3′) Обратное направление (антисмысловое) R11 (ПЦР) 1384-1400 CGGTGTGTACAAGGCCC R1193 1174-1192 CGTCATCCCCGCCTTCCTC R1353 1336-1352 CGATTACTAGCGATTCC R961/R7 949-963 TCGAATTAAACCACA R5 786-802 CTACCAGGGTATCTAAT R361/R1 340-355 CTGCTGCCTCCCGTAGG Прямое направление (смысловое) FD1/F1 (ПЦР) 8-26 AGAGTTTGATCCTGGCTCA F1353 1336-1352 GGAATCGCTAGTAATCG F361 340-355 CCTACGGGAGGCAGCAG F961 949-963 TGTGGTTTAATTCGA а Все положения мишеней праймеров соответствуют системе нумерации для E.coli (Brosius et al., 1978)

10.3 Анализ данных

Полученные последовательности 16S pДНК подвергали автоматическому сопоставлению с последовательностями, полученными из Проекта по рибосомальной базе данных (RDP; Maidak et al., 1996), используя программу совмещения CLUSTALW (Genetics Computer Group, 1991). Последовательности в профиле урезали с тем, чтобы стандартизировать по размеру последовательности каждого организма, включенного в профиль сопоставления. Общее число положений нуклеотидов в последовательностях, включенных в профиль, равно 1388. В профиль сопоставления были включены опубликованные последовательности ряда организмов, встречающихся в рубце (табл.2). Сомнительные последовательности в профиле сопоставления совмещали вручную с помощью редактора сопоставления Genetics Data Enviroment (GDE) (Smith et al., 1992). Для проверки филогенетического родства использовали программу fastDNAml (Olsen et al., 1994), которая основана на алгоритме максимального правдоподобия (Felsenstein, 1981). При помощи программы Treetool (GDE) было построено филогенетическое древо. В качестве внешних групп при построении древа служили Escherichia coli и Acinetobacter calcoaceticus.

Таблица 2
Организмы, включенные в профиль сопоставления с помощью программы CLUSTALW. Все последовательности были получены из баз данных RDP и Genbank
Lactobacillus ruminis АТСС 27780 Streptococcus bovis ATCC 33317
Fibrobacter succinogenes S85 АТСС 1916 Methanobrevibacter ruminantium ATCC 35063
Megasphaera elsdenii АТСС 17752 Methanobacterium formicicum DSM 1312
M.elsdenii АТСС 25940 Methanosarcina barkeri DSM 1538
M.elsdenii СН4 Methanomicrobium mobile ATCC 35094
M.elsdenii СН7 Prevotella ruminicola ATCC 19189
M.cerevisiae Wolinella succinogenes ATCC 33913
Synergistes jonesii Escherichia coli
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Acinetobacter calcoaceticus ATCC 33604
Eubacterium cellulosolvens ATCC 43171 Quinella ovalis
Eubacterium uniformis ATCC 35992 Selenomonas ruminantium GA192
Clostridium polysaccharolyticum ATCC 33142 Eubacterium limosum ATCC 8486

Выделение в условиях ауксостата

Выделение утилизирующих лактат бактерий в условиях ауксостата

Выделение 1. Содержимое рубца коровы 8710, заполняющее сосуд для культивирования ферментера, немедленно подвергалось воздействию свежей стерильной селективной среды при запуске режима ауксостата при повышении pH. Вначале степень разбавления составляла около 0,53 час -1 на протяжении первых двух часов при pH 5,30. В течение следующих двух часов степень разбавления увеличилась до 0,65 час -1 . Для того чтобы повысить специфичность выделения, pH понижали до 5,0, что привело к уменьшению степени разбавления до 0,37 час-1. Культивирование продолжали еще 24 часа, после чего в обогатительной культуре обнаруживались только два морфологических типа. Степень разбавления несколько снижалась по мере возрастания продолжительности культивирования после начального 24-часового периода и под конец выделения она составила только 0,33 час -1 .

Образец содержимого ферментера наносили штрихом на агаризованную среду в анаэробном боксе, и отдельные колонии, содержащие чистую культуру, переносили на косячки с агаром и хранили в жидком азоте; эта культура получила обозначение изолят CH1.

Выделение 2. При этом выделении из содержимого рубца коровы 8812 наблюдалась степень разбавления 0,25 час -1 в первые 24 часа, а в последующие 24 часа степень разбавления составляла от 0,34 до 0,41 час -1 . После 48 часов культивирования было неясно, получена ли чистая культура, и культивирование продлили еще на 24 часа. Степень разбавления в этот период составила 0,41 час -1 и была выделена чистая культура из ферментера в виде колонии из чашки Петри. Этот изолят обозначили как изолят CH2.

Выделение 3. Степень разбавления за время этого выделения снижалась с 0,28 до 0,21 час -1 в течение 48 часов. Изолят, полученный из рубца коровы 8708, обозначили как изолят CH3.

Выделение 4. Поначалу степень разбавления составляла порядка 0,38 час -1 , но в течение 4 часов она снизилась до 0,276 час -1 , а под конец 48-часового периода степень разбавления составила 0,197 час -1 . Изолят, полученный при этом выделении из содержимого рубца коровы 8826, обозначили как CH4.

Выделение 5. В конце периода выделения преобладали спорообразующие микроорганизмы и эксперимент был прекращен.

Выделение 6. При этом выделении степень разбавления снижалась таким же образом, как и при других выделениях, и конечная степень разбавления составила только 0,116 час -1 . Изолят был получен из содержимого рубца откармливаемого скота и получил обозначение как CH6.

Выделение 7. Содержимое рубца, использованное при этом выделении, было получено из откармливаемого скота. Степень разбавления снижалась с 0,142 до 0,106 час -1 за первые 7 часов выделения. Полученный изолят был обозначен как CH7.

Подбор сред для исследований в условиях хемостата

При выделении утилизирующих лактат культур наблюдалось постоянное снижение степени разбавления, что указывало на то, что состав среды не был оптимальным. За первые 24 часа при выделении 7 степень разбавления снизилась с 0,142 до 0,106 час -1 . Прямо в ферментер добавили одноразовую дозу в 5 мл стерильной жидкости из рубца и через 4 часа степень разбавления достигла пика в 0,408 час -1 . После этого степень разбавления медленно снизилась до 0,15 час -1 . Такой «импульсный» метод показал, что в среде недостает питательных веществ.

Другой «импульсный» эксперимент с добавлением 1 мл раствора витаминов привел к увеличению степени разбавления лишь до 0,28 час -1 . Однако внесение большей дозы витаминов привело к достижению пика степени разбавления в 0,497 час -1 , что было выше, чем при добавлении содержимого рубца. Утилизация лактата отражала аналогичные результаты, а именно: без добавления витаминов утилизация D- и L-изомеров лактата составила 22% и 86%, соответственно, а с добавлением витаминов — 68 и 91%, соответственно. Среда 1, представленная в Методах, отражает модифицированный вариант с повышенной концентрацией витаминов. Во время другого «импульсного» эксперимента было установлено, что дрожжевой экстракт увеличивает выход клеток изолятов.

Скорость роста Megasphaera elsdenii АТСС 25940 и изолятов из ауксостата в зависимости от pH

Скорость роста бактерий определяли с помощью pH-ауксостата при различных значениях pH в диапазоне от 4,5 до 6,5, используя модифицированную лактатную среду. Эти скорости роста сравнивали с величинами, полученными при культивировании в замкнутом объеме при определенных значениях pH, и использовали средние значения.

Типовой штамм Megasphaera elsdenii АТСС 25940 проявлял увеличение скорости роста при pH от 4,5 до 6,0, после чего следовало резкое снижение скорости роста при pH 6,5 (фиг.1). Максимальная скорость роста, достигнутая АТСС 25940, составила 0,66 час -1 , что соответствует скорости роста в 0,6 час -1 в работе Therion et al. (1981).

Все изоляты превосходили АТСС 25940 по максимальной скорости роста, особенно при значениях pH 5,5 и ниже (фиг.1). Максимальная скорость роста у всех изолятов наблюдалась при pH 5,5, при этом скорости роста составили 0,66, 0,93, 0,938 и 0,864 час -1 у изолятов СН7, СН6, СН4 и СН3, соответственно. Из всех изолятов СН4 оказался наиболее кислотостойким, достигая скорости роста в 0,389 час -1 при pH 4,5, тогда как второй по кислотостойкости организм СН6 проявлял скорость роста только в 0,19 час -1 при pH 4,5. Наблюдалось резкое снижение скорости роста при pH между 5,5 и 6,0 у трех изолятов, а именно СН6, СН4 и СН3. Изолят СН7 проявлял только небольшие отклонения в скорости роста при pH между 5,5 и 6,0, что напоминает поведение АТСС 25940 при pH между 5,5 и 6,5.

Скорости роста изолятов из ауксостата на глюкозе

Скорости роста трех изолятов определяли при pH 5,0, 5,5 и 6,0 в условиях подпитываемой культуры (фиг.2). Скорости роста у всех трех изолятов были значительно ниже на глюкозе, чем на лактате. Наиболее перспективный изолят на лактате, а именно СН4, достигал максимальной скорости роста только в 0,24 час -1 на глюкозе при pH 5,5 по сравнению с 0,938 час -1 на лактате. Изолят СН7 обладал самой высокой среди изолятов скоростью роста (0,33 час -1 ) на глюкозе при pH 6,0.

Превращение лактата изолятом СН4

Изолят СН4 культивировали в условиях хемостата при трех степенях разбавления в 0,94, 0,83 и 0,75 час -1 на лактатной среде. В стационарной фазе отбирали пробы и анализировали на содержание летучих жирных кислот (ЛЖК) и определяли утилизацию лактата. Также проводили культивирование в замкнутом объеме, отбирая пробы в стационарной фазе. Образцы стерильной среды также анализировали на содержание ЛЖК и лактата. С увеличением степени разбавления относительное образование жирных кислот изменялось, а именно, при низких степенях разбавления образовывалось больше бутирата и валерата и меньше пропионата и ацетата (табл.3). При наибольшей степени разбавления образовывались очень малые количества бутирата при полном отсутствии валерата и лишь немного больше ацетата и пропионата. Утилизация лактата, как и ожидалось, снижалась с возрастанием степени разбавления. При культивировании в условиях D=0,75 более 40% лактата превращалось в ЛЖК и, хотя утилизация лактата была интенсивной, большая часть доступной энергии пропадала. Когда СН4 культивировали в замкнутом объеме, он образовывал главным образом ацетат и пропионат. Концентрация образующихся ЛЖК при культивировании в замкнутом объеме была гораздо ниже, чем ожидалось, и единственным объяснением этому может быть то, что СН4 утилизирует ЛЖК при нехватке лактата.

Таблица 3
Летучие жирные кислоты, образованные изолятом СН4 из лактата при культивировании в хемостате при различных степенях разбавления и при культивировании в замкнутом объеме
Степень разбавления
(час -1 )
Летучие жирные кислоты (мМ) Утилизация лактата (%)
уксусная пропионовая n-масляная n-валериановая
0,75 7,221 5,779 11,347 6,383 92,66
0,83 10,048 12,293 0,423 0,012 53,54
0,94 8,529 10,517 0,271 39,65
Замкнутый объем 10,659 7,737 0,266 97,62

Выделение и скринирование методом рассева на чашках

Более 800 колоний из девяти образцов из рубцов четырех особей молочного скота и двух особей откармливаемого скота инокулировали в микропробирки с жидкой средой IRFL. Из них 610 изменяли окраску среды на пурпурную за 16 часов инкубации. Для дальнейших исследований были выбраны девятнадцать из проскринированных изолятов, поскольку они соответствовали требованиям.

Четыре из выбранных изолятов — AW09, AW10, AW11 и AW12 обладали способностью к росту при начальном pH 4,5. Все остальные пятнадцать изолятов росли при начальном pH 5,0, и проводилась дальнейшая селекция для отбора культур с подходящими свойствами, причем отбирались самые быстрорастущие при pH 5,0.

Все девятнадцать изолятов были устойчивы к ионофорам монензину и лазалоциду в концентрациях 10 ppm, утилизировали лактат в присутствии мальтозы и глюкозы и были способны расти как на глюкозе, так и на мальтозе. Все эти девятнадцать изолятов представляли собой грамотрицательные кокки (±1,8 мкм), встречающиеся парами или в виде цепочек.

Физиологическая характеристика изолятов

Все изоляты AW утилизировали как L-, так и D-изомер лактата, поскольку оба изомера были практически полностью утилизированы после инкубации в среде SDL в течение 24 часов. Результаты показывают, что изоляты составляют довольно однородную группу, поэтому для дальнейших исследований были выбраны только определенные изоляты. У пяти изолятов AW скорость роста на глюкозе при pH 5,8 варьировала от 0,38 до 1,05 час -1 , со средним значением 0,66 час -1 (±0,298). При проверке изолятов AW на образование ЛЖК из DL-лактата оказалось, что они образуют уксусную, пропионовую, n-масляную и n-валериановую кислоты в следующем соотношении: 2:1,5:1:1,3. Некоторые изоляты AW образовывали следовые количества метилмасляной кислоты. Максимальная скорость накопления биомассы у девяти изолятов варьировала от 0,31 до 0,43 г (л×час) -1 . Самая высокая скорость накопления биомассы была у AW15, а за ним следовали СН4 и AW01 на уровне 0,39 г (л×час) -1 . Выход сухой массы клеток на 1 г утилизированной молочной кислоты варьировал от 0,1 до 0,17 у этих девяти изолятов.

Предположительная идентификация изолятов

Полученные изоляты были подвергнуты предположительной идентификации и те, которые соответствовали морфологическому типированию как штаммы Megasphaera elsdenii, использовались для дальнейшей характеристики.

Испытания на овцах для оценки способности изолята СН4 к предотвращению накопления молочной кислоты в рубце

Результаты первого испытания на овцах представлены в табл.4.

Таблица 4
Концентрация молочной кислоты в рубцовой жидкости овец, получавших грубые корма, при внезапном переходе на концентраты и при введении в рубец СН4 (опыт) или плацебо (контроль) в одно и то же время
Время после введения СН4 (час) Концентрация молочной кислоты (г/л)
опыт с СН4 Контроль
1 Значение p для попарного сравнения
1 2 3 4 +СН4 и -СН4 1 и 2 3 и 4
Число коров в опыте 15 15 15 15
Потребление сухого вещества (кг/сутки) 24,6 24,1 23,1 22,2 0,28 0,59 0,32
Молоко (кг/сутки) 36,4 34,0 33,8 32,2 0,10 0,16 0,34
Жир (%) 3,27 3,29 3,57 3,23 0,17 0,85 0,03
Белок(%) 3,10 3,10 3,14 3,07 0,43 0,93 0,23
Вес тела 662 608 618 612 0,02 0,004 0,73
Состояние в баллах 2,80 2,48 2,45 2,28 0,06 0,08 0,36

Опыт 1: контрольный рацион, содержащий 70% концентратов +СН4

Опыт 2: контрольный рацион, содержащий 70% концентратов -СН4

Опыт 3: контрольный рацион, содержащий 60% концентратов +СН4

Опыт 4: контрольный рацион, содержащий 60% концентратов -СН4

Таблица 7
Влияние изолята СН4 на продуктивность дойных коров в течение 80 дней после отела (высокопродуктивные животные)
Параметры Опыт 1 Значение p для попарного сравнения
1 2 3 4 +СН4 и -СН4 1 и 2 3 и 4
Число коров в опыте 10 10 10 10
Потребление сухого вещества (кг/сутки) 24,6 25,4 24,3 22,6 0,44 0,43 0,06
Молоко (кг/сутки) 39,3 35,9 35,2 34,8 0,13 0,06 0,82
Жир (%) 3,23 3,24 3,56 3,21 0,20 0,91 0,06
Белок(%) 3,10 3,10 3,15 3,02 0,28 0,93 0,11
Вес тела 644 597 623 625 0,11 0,02 0,90
Состояние в баллах 2,71 2,26 2,34 2,44 0,20 0,02 0,61

Влияние добавления Megasphaera elsdenii на здоровье животных и эффективность откорма

Количество живых бактерий СН4, вводимых одному животному, составляло 2×10 11 колониеобразующих единиц на дозу на одно животное во всех опытах по откорму. Наиболее важные результаты представлены в табл.8-11. Период с третьей по пятую неделю при откорме обычно считается самым критическим в смысле пищевой адаптации. В течение первой и второй недели рацион все еще содержит большую долю грубых кормов, которая постепенно понижается. Потребление концентратов начинается на сравнительно низком уровне и постепенно возрастает. Только начиная с третьей недели рацион содержит самый низкий уровень грубых кормов (и самый высокий уровень концентратов) и потребление корма быстро возрастает. К началу шестой недели обычно считается, что животные адаптировались к рациону. Недели с третьей по пятую действительно являются критическим периодом адаптации животных к высокому содержанию концентратов.

Таблица 8
Среднесуточное потребление корма (кг съеденного корма на одно животное на сутки) при введении СН4 против контроля (без добавления СН4) в различные периоды откорма
Период откорма Условия опыта Значение p SE
Опыт (с СН4) Контроль (без СН4)
1-2 недели 7,30 7,15 0,35 0,109
3-5 недели 10,18 10,02 0,30 0,103
1-13 недели 9,64 9,50 0,29 0,092

Общее потребление корма было немного (но не значительно) выше у получавших СН4 животных, чем у контрольных. В течение 3-5 недели кастрированные бычки, не получавшие ионофор, но получавшие СН4, потребляли значительно (p a АТСС 25940 b СН4 СН7 АТСС 17752 87 G G А G 105 С Т С Т 170 Т С С Т 221 Т C С Т 241 G А А G 283 А G G А 418 А * * * 529-530 CG * * CG 533-536 CG** CGAC CGAC GC** 539 Т С С Т 550-552 ТАС CGT CGT ТАТ 556 G А А G 711 G G G С 718 * * * G 850 А А G А 1084 А G А А 1105-1108 TGGA AGGG AGGG TGGA 1117-1120 ТССА СССТ СССТ ТССА 1290 А * А * 1297-1300 AAGT CGGC AAGT CGGC 1396 А С А А 1425 А А G А 1437 G А G G 1492 Т С С Т а Система нумерации по E.coli (Brosius et al., 1978). b Типовой штамм. Звездочкой показано, куда при совмещении был введен разрыв вследствие появления делеции или вставки нуклеотидов в каком-либо положении последовательности соответствующих изолятов и штаммов.

Метод наибольшего правдоподобия, включающий нахождение древа, дающего наибольшую вероятность соответствия полученным данным по секвенированию (Felsenstein, 1981), использовали для выведения филогенетического древа из последовательностей, включенных в профиль совмещения (фиг.3). Этот метод имеет преимущество перед традиционными методами достаточности, которые могут привести к получению ошибочных древ, если различные потомки будут возникать с неравными скоростями, в том, что он учитывает возможность эволюции с различной скоростью в различных линиях (Felsenstein, 1981). Поскольку на топологию древа также влияет количество используемых организмов и выбор заведомо неродственных организмов для сравнения (Stackebrandt and Ludwig, 1994; Stackebrandt and Rainey, 1995), в профиль совмещения был включен целый ряд явно родственных и явно неродственных организмов, встречающихся в рубце. Впоследствии их использовали для создания древа. Хотя филогенетическое древо было выведено только на основании неполных (92%) последовательностей генов 16S pPHK, что могло бы уменьшить разрешение между близкородственными организмами (Utaker et al., 1995; Li and Graur, 1991), было показано, что общая топология древ, полученных как из полных, так из неполных последовательностей, в целом совпадает друг с другом (Van Camp et al., 1993; Vandamme et al., 1996).

Vandamme et al. (1996) предположили, что различные изоляты можно рассматривать как представителей одного и того же вида, если их последовательности pPHK гомологичны более чем на 97%, они обладают фенотипическим сходством и проявляют значительную степень гибридизации ДНК:ДНК. Несмотря на то, что соотношение между сходством ДНК и гомологией 16S pPHK между разными организмами далеко не линейно, Fox et al. (1992) предположили, что действительная идентичность последовательностей 16S pPHK должна означать, что два организма являются представителями одного и того же вида, поскольку это почти всегда подтверждается гибридизацией ДНК:ДНК. Хотя одни только данные последовательностей 16S pPHK не могут быть достаточными во всех случаях определения видов, они чрезвычайно полезны для определения того, к какому виду предположительно принадлежит штамм, если только соответствующий вид представлен в базе данных последовательностей 16S pPHK. Штаммы с почти идентичными последовательностями 16S pPHK следует относить к одному и тому же «супервиду по pPHK» или «комплексу видов по pPHK». Следовательно, описываемые изоляты СН4 и СН7, фенотипически предположительно идентифицированные как штаммы М. elsdenii, следует отнести к одному комплексу видов по pPHK, который будет включать эталонные штаммы этого вида — типовой штамм АТСС 25940 и штамм АТСС 17752. Поскольку филогенетические взаимоотношения соответствующих изолятов также совпадают с их фенотипическими характеристиками, эти изоляты можно рассматривать как штаммы вида Megasphaera elsdenii. То, что последовательности 16S pДНК M.cerevisiae и M.elsdenii гомологичны только на 92%, вместе с генетическими и фенотипическими данными, подтверждает деление рода на два хорошо отделенных вида.

Среди бактерий рубца, включенных в данное исследование, наиболее близкими к кластеру Megasphaera, по-видимому, являются Selenomonas ruminantium и Quinella ovalis. Очевидное филогенетическое родство между Megasphaera elsdenii и Selenomonas ruminantium находится в соответствии с фенотипическими и генетическими свойствами, общими для этих двух организмов, такими как близкое содержание G+C в ДНК (53-54%), анаэробность, хемоорганотрофический метаболизм и утилизация одних и тех же субстратов (Stackebrandt et al., 1985; Stewart and Bryant, 1988; Haikara, 1992). Работа Stackebrandt et al. (1985), применивших метод олигонуклеотидной каталогизации для выявления филогенетических взаимоотношений между видами, подтверждает это филогенетическое родство. С другой стороны, Selenomonas ruminantium также близкородственна сравнительно неизвестному организму Quinella ovalis, который размножается в рубце, когда животное получает корм, богатый сахарами. Эти организмы, хотя они еще не введены в культуру, обладают некоторыми физиологическими свойствами, общими с таковыми у крупных селеномонад, обнаруженных у овец (Stewart and Bryant, 1988). Как и ожидалось, наиболее отдаленными родственниками Megasphaera, встречающимися в рубце, являются бактерии, входящие в кластер архебактерий-метаногенов, представители которого, как полагают, появились около 600-800 млн. лет тому назад (van Soest, 1994; Woese, 1987). Скорость эволюции у этих организмов также медленнее, чем у Bacteria, и примитивность этой группы четко отражается в сильно разветвленном кластере метаногенов.

Недавнее расхождение различных штаммов M.elsdenii, возможно, объясняется совершенствованием их фенотипа с целью адаптации к очень селективным условиям в рубце. Согласно Woese (1987), эволюция фенотипа любого организма является процессом, при котором появляются новые или более эффективные признаки для выживания в определенной нише. Совершенствование должно приводить к появлению организмов с универсальным метаболизмом, как в случае Megasphaera. С другой стороны, медленнее эволюционирующие метаногены по сравнению с ними метаболически однообразны.

Данное исследование показывает пригодность секвенирования 16S pДНК для различения близкородственных штаммов вида M.elsdenii. Кроме того, оно обеспечивает филогенетические рамки для идентификации свежевыделенных штаммов, уже охарактеризованных фенотипически. Эти рамки имеют особенную ценность, когда они служат основой для разработки видо- и штаммоспецифичных зондов, предназначенных для исследований по экологии рубца.

Введение бромкрезола пурпурного в среду IRFL для облегчения определения бактерий, утилизирующих лактат, оказалось успешным в случае быстрорастущих бактерий, утилизирующих лактат, которые представляли основной интерес в данном исследовании. На ранних стадиях инкубации они образуют пурпурные зоны вокруг колоний, которые четко контрастируют с желтоватым фоном агаризованной среды. Однако при продолжительной инкубации градиент pH вокруг колоний диссипирует вследствие диффузии ионов и весь фон становится пурпурным. Тогда становится трудно отличить медленно растущие колонии, утилизирующие лактат, от тех организмов, которые растут на других источниках углерода, попадающих в жидкость рубца.

M.elsdenii не является доминирующим видом, утилизирующим лактат, у животных на рационе с высоким содержанием концентратов (Mackie et al., 1978; Mackie & Gilchrist, 1979; Mackie et al, 1984; van Gylswyk, 1990), но существует множество причин, почему он может преобладать при проведении процедур отбора и скринирования.

Некоторые из подвергавшихся скринированию колоний состояли из селеномонад и других морфологических типов. Большая часть этих колоний не была отобрана, поскольку не было положительного признака того, что они могут утилизировать лактат в присутствии растворимых сахаров. Russel & Baldwin (1978) показали, что в мультисубстратной среде M.elsdenii В159 одновременно использует глюкозу, мальтозу и лактат, но не сахарозу. Marounek et al. (1989) показали, что четыре штамма M.elsdenii утилизировали лактат быстрее, чем глюкозу в средах с обоими источниками углерода.

Некоторые другие лаборатории, исследовавшие возможность заселения жвачных животных, потребляющих корма с высоким содержанием концентратов, утилизирующими лактат организмами для предотвращения накопления лактата, также работали со штаммами М. elsdenii (Das, 1979; Leedle et al., 1991; Robinson et al., 1992; Kung & Hession, 1995; Wiryawan & Brooker, 1995). Но было невозможно сравнить скорости роста изолятов AW и СН со штаммами из литературы, чтобы определить, имеют ли они более высокие скорости роста и являются более кислотостойкими, поскольку таких данных нет в литературе. Однако изоляты AW и СН можно сравнить с типовым штаммом M.elsdenii АТСС 25940.

У изолятов AW область значений pH, при которых определяли рост, не была достаточной для определения диапазона pH для выделенных штаммов или оптимального pH для роста. Однако можно полагать, что оптимум будет свыше pH 5,7 и самое низкое значение pH находится между pH 4,5 и pH 4,9 для всех, кроме четырех изолятов, поскольку не было роста на чашках со средой IRFL при pH 4,5. Это соответствует данным работы, проведенной на типовом штамме М. elsdenii АТСС 25940. Диапазон pH для типового штамма M.elsdenii АТСС 25940 составляет от 4,6 до 7,8 при оптимуме для роста при pH 6,05 (Therion et al., 1982).

У изолятов СН оптимум pH для роста находится между pH 5 и 6. В области исследованных значений pH самые высокие скорости роста были при pH 5,5. Обе группы изолятов на среде SDL обладали большей скоростью роста, чем типовой штамм. Скорости роста штамма M.elsdenii АТСС 25940 в среде SDL сравнимы с теми, что были получены предшествующими исследователями на лактатной среде (Therion et al., 1982).

Скорости роста изолятов на лактате были выше, чем на глюкозе и мальтозе. Это согласуется с предыдущим исследованием на M.elsdenii АТСС 25940, в котором оказалось, что скорость роста на лактатной среде при pH между 5,0 и 6,5 была выше, чем на глюкозной среде (Therion et al., 1982). Вне этого интервала pH скорость роста на глюкозе была выше. Изучение субстратного предпочтения бактерий рубца показало, что рост M.elsdenii (В 159 на лактате был медленнее, чем на глюкозе и мальтозе, хотя pH среды в этом исследовании был выше 6,5 (между 6,75 и 6,9) (Russel & Baldwin, 1978).

Состав конечных продуктов сбраживания на лактатной среде был установлен у четырех штаммов М. elsdenii, включая типовой штамм LC1 или АТСС 25940 (Marounek et al., 1989). Эти результаты показали вариабильность соотношения образовавшихся жирных кислот в зависимости от штамма. Три штамма образовывали мало валериановой кислоты либо вовсе ее не образовывали, тогда как 22 мол.% конечных продуктов у M.elsdenii L8 составляла валериановая кислота (Marounek et al., 1989). Девять изолятов AW, протестированных в настоящем исследовании, не проявляли такого разброса от штамма к штамму по продукции валериановой кислоты, как это было у штаммов, проверенных Marounek et al. (1989), но они были близки к M.elsdenii L8, который был выделен из рубца теленка, получавшего молочный рацион. Однако СН4 вырабатывал такие же конечные продукты сбраживания, как и типовой штамм.

С точки зрения максимальной скорости накопления биомассы на среде SDL штамм AW15 был бы наилучшим для получения большого количества клеток для опытов на животных, а штаммы СН4 и AW01 следуют сразу после него. Время для наработки 100 г сухой массы клеток на среде SDL в хемостате с рабочим объемом в 5 л будет составлять 1,9 дней у AW15 и 2,1 дня у СН4 и AW01.

Скорости роста отобранных изолятов на лактате выше по сравнению с типовым штаммом M.elsdenii. Выделенные штаммы кислотоустойчивы и могут расти при значениях pH ниже 5,0. Они устойчивы к ионофорам, обычно добавляемым при откорме, и могут утилизировать оба изомера молочной кислоты даже в присутствии глюкозы и мальтозы. Конечным продуктом сбраживания лактата являются летучие жирные кислоты (ЛЖК), которые является важным источником энергии у жвачных животных. Образование пропионата особенно важно при промышленном откорме, поскольку пропионат является основным источником глюкозы для тканей жвачных животных. Таким образом, изоляты обладают свойствами, необходимыми для эффективной борьбы с лактоацидозом у жвачных.

Выращивание утилизирующих лактат организмов было успешным при применении среды, не содержащей жидкости из рубца. Единственным изменением исходной среды было повышение содержания витаминов и добавление дрожжевого экстракта в среду. Бактерии отлично выживали на этой среде при 4°С вплоть до 20 дней при использовании их в качестве рабочей культуры.

Метод с применением pH-ауксостата для обогащения утилизирующих лактат бактерий рубца с заданным сочетанием биохимических/физиологических свойств, которые делают эти бактерии потенциально более пригодными для предупреждения и борьбы с лактоацидозом при откорме животных, оказался очень успешным. В большинстве случаев в ферментере устанавливалась быстро растущая морфологически гомогенная популяция через два дня после запуска цикла. Последующие проверки культур, полученных из содержимого ферментера путем посева на чашки, подтвердили, что эти культуры обладают требуемым набором характеристик.

Предположительная идентификация изолятов из обогащенных культур показала, что все они, кроме одного, принадлежат к виду Megasphaera elsdenii.

Таблица 14
Сравнение метода выделения с применением pH-ауксостата и стандартного метода рассева и скринирования на чашках
Параметр Традиционный метод на чашках Ауксостат
Продолжительность (дни) 90 9
Время (ч), потраченное человеком 180 7
Образец: количество бактерий (к.о.е.) 12×10 10 14×10 12
Максимальная удельная скорость роста (ч -1 ) 0,91 0,90
Выход биомассы (г/л) 0,60 0,59
Скорость накопления биомассы г (л×ч) -1 0,39 0,39

Поскольку выделенные штаммы проявили себя лучше, чем АТСС 25940 при pH ниже 6,0, то они больше подойдут для значений pH, встречающихся в рубце откармливаемых животных, которые обычно меньше pH 6,0. Более того, изолят СН4 оказался наиболее подходящим для экспериментов на откармливаемых животных.

Культивирование утилизирующих лактат изолятов на глюкозе оказалось неприемлемым вследствие низкой скорости роста по сравнению со скоростью роста на лактате.

Тридцать коров, которым вводили изолят СН4, давали значительно больше молока (р=0,10), имели в среднем больший вес тела (p=0,02) и общее состояние организма (р=0,06). Жирность молока у коров, получавших рацион с 60% концентратов +СН4, также значительно повышалась (3,57%) против 3,23%).

Испытания на молочных животных

Потребление сухого вещества не изменялось, но продукция молока значительно возрастала на 3,4 кг/день с 35,9 кг/день до 39,3 кг/день (Р=0,06), когда коровам давали корм с 70% концентратов и вводили изолят СН4. Продукция молока имела тенденцию к возрастанию (р=0,13), если сравнивать всех коров, получавших СН4, с коровами, не получавшими его. Вес тела и показатели состояния организма повышались (р=0,02), когда высокопродуктивным коровам, получавшим корм с высоким содержанием концентратов, вводили изолят СН4. Введение СН4 коровам, получавшим корм с 60% концентратов, вело к значительному повышению жирности молока (р=0,06) с тенденцией к повышению содержания молочного белка (р=0,11). Компоненты молока играют важную роль в действующих схемах оплаты за молоко.

Введение коровам изолята СН4 значительно повышало выработку молока и положительно влияло на состав молока, вес тела и состояние организма. Потребление сухого вещества не изменялось; таким образом, результаты свидетельствуют, что введение коровам организма СН4 создает более благоприятную среду в рубце, что ведет к улучшению утилизации питательных веществ.

Эксперименты на откармливаемых животных

Значительное улучшение среднесуточного привеса (ССП) и коэффициента конверсии корма (ККК) в критический период откорма (3-5 недели), а также общее снижение расстройств пищеварения у получавших СН4 животных по сравнению с контрольными животными показало, что введение СН4 откармливаемым животным может давать следующие эффекты:

— оно способствует адаптации при переходе от грубых кормов на концентраты, как было в этих экспериментах. СН4 также смягчает ухудшение эффективности рациона с низким содержанием грубых кормов по сравнению с рационом с высоким содержанием грубых кормов на ранних стадиях адаптации;

— данный способ применения СН4 эффективен тем, что позволяет его экспрессию в соответствии с назначением;

— применение СН4 эффективно предупреждает ацидоз, о чем прямо свидетельствует снижение числа наблюдавшихся случаев ацидоза и косвенно — улучшение состояния в критической фазе откорма, когда вероятнее всего возникновение ацидоза. Все это наблюдалось при тех рационах и режимах кормления, которые дают особенно высокий риск ацидоза (особенно на ранних стадиях откорма), и было более выражено, когда не применялись инофоры;

— СН4 может применяться в качестве ветеринарного средства, способствующего предупреждению и/или лечению ацидоза, о чем свидетельствует резкое падение случаев ацидоза при применении СН4 по сравнению с контролем;

— СН4 может применяться для улучшения эффективности откорма, включая скорость роста (тем самым уменьшая время, необходимое для откорма) и эффективность конверсии корма;

— СН4 может применяться для того, чтобы можно было проводить откорм на рационе с высоким содержанием концентратов, т.е. использовать меньшее количество грубых кормов, и для увеличения скорости перехода от рациона с высоким содержанием грубых кормов на рационы с высоким содержанием концентратов, т.е. опять же меньше использовать грубые корма. Это дополнительно подтверждается наблюдением на ранних стадиях откорма, когда отрицательный эффект низкого содержания грубых кормов по сравнению с высоким содержанием значительно смягчался при введении СН4.

Авторы настоящего изобретения, также нашли, что по сравнению с известными штаммами M.elsdenii штамм M.elsdenii СН4:

— высокоактивен и адаптирован к размножению в рубце животных на рационе с высоким содержанием концентратов;

— способен к размножению при относительно низких значениях pH ниже 5,0 и даже при pH 4,5, что определяется как острый ацидоз;

— устойчив к антибиотикам-ионофорам, обычно добавляемым в рацион откорма;

— способен к преимущественному использованию лактата в качестве источника углерода, даже в присутствии растворимых углеводов, таких как глюкоза и мальтоза.

Далее, преимущества этого штамма состоят в том, что:

— он имеет сравнительно высокую скорость роста, т.е. более 0,938 час -1 ;

— обладает способностью расти на восстановительных сахарах так же, как и на лактате;

— имеет относительно высокую скорость накопления биомассы, т.е. более 0,39 г(л×час) -1 ;

— устойчив к ионофорам;

— образует преимущественно ацетат, а не пропионат и бутират; и

— имеет уникальную последовательность 16S pРНК и поэтому является новым штаммом.

Авторы настоящего изобретения к тому же обнаружили, что животные, которым вводили мальтозу непосредственно в рубец, или переведенные внезапно с грубых кормов на высокое содержание концентратов, не проявляют измеримого накопления лактата в рубце при введении СН4.

Более того, высокопродуктивные молочные коровы при введении СН4 дают на 2,4-3,2 литра молока больше, чем контрольные животные, которым не вводили СН4. Показатели состояния организма, так же как и вес тела у коров, которым вводили СН4, были статистически значимо выше, чем у контрольных животных.

Следует иметь в виду, что в отношении микроорганизма по изобретению и его применения возможны изменения в деталях, не выходящие за рамки прилагаемой формулы изобретения.

1. Штамм M.elsdenii, депонированный в NCIMB, Aberdeen, Scotland, UK, под номером NCIMB 41125, характеризующийся способностью к утилизации лактата со степенью от 40 до 90% даже в присутствии сахаров, устойчивостью к ионофорам, высокой скоростью роста, способностью к преимущественной продукции ацетата и способностью к пролиферации при pH менее 5,0.

2. Композиция для облегчения перевода жвачных животных с рациона на основе грубых кормов на высокоэнергетический рацион на основе концентрированных кормов, состоящая в основном из штамма по п.1.

3. Способ облегчения перевода жвачных животных с рациона на основе грубых кормов на высокоэнергетический рацион на основе концентрированных кормов, включающий введение в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма по п.1.

4. Кормовая добавка для жвачных животных, предназначенная для облегчения перевода жвачных животных с рациона на основе грубых кормов на высокоэнергетический рацион на основе концентрированных кормов, содержащая инокулят, состоящий из эффективного количества штамма по п.1, и носитель.

5. Кормовая добавка по п.4, в которой носителем служит стерильная анаэробная питательная среда, и в которой инокулят и питательная среда размещаются соответственно в отдельных стерильных анаэробных камерах одного и того же анаэробного контейнера, при этом указанные камеры анаэробно соединены одна с другой для инокуляции питательной среды инокулятом в анаэробных условиях.

6. Способ лечения и профилактики лактоацидоза жвачных животных и одного или более связанного с ним состояний, включающих воспаление рубца, спровоцированное лактоацидозом воспаление копыта, спровоцированные лактоацидозом абсцессы в рубце как следствия чрезмерного скопления газов в рубце и печени, включающий анаэробное введение в рубец жвачного животного эффективного количества штамма по п.1.

7. Ветеринарное средство для лечения и профилактики лактоацидоза у жвачных животных и одного или более связанных с ним состояний, включающих воспаление рубца, спровоцированное лактоацидозом воспаление копыта, спровоцированные лактоацидозом абсцессы в рубце как следствия чрезмерного скопления газов в рубце и печени, содержащее эффективное количество штамма по п.1.

8. Способ повышения молочной продуктивности жвачных животных, включающий введение в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма по п.1.

9. Способ по п.8, в котором штамм по п.1 вводят в анаэробных условиях.

10. Способ повышения эффективности откорма в случае скармливания жвачным животным рациона на основе концентрированных кормов, включающий введение в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма по п.1.

11. Способ по п.10, в котором штамм по п.1 вводят в анаэробных условиях.

12. Способ повышения скорости роста и сокращения времени откорма жвачных животных, включающий введение в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма по п.1.

13. Способ по п.12, в котором штамм по п.1 вводят в анаэробных условиях.

14. Способ снижения заболеваемости, обусловленной нарушениями пищеварения, и смертности среди жвачных животных от лактоацидоза и связанных с ним состояний и сокращения случаев лактоацидоза и связанных с ним состояний у жвачных животных, включающий введение в рубец указанных жвачных животных эффективного количества штамма по п.1.

15. Способ по п.14, в котором штамм по п.1 вводят в анаэробных условиях.

16. Способ улучшения эффективности конверсии рациона жвачного животного на основе концентрированных кормов у жвачного животного при переводе его на указанный рацион, включающий введение в рубец указанного жвачного животного эффективного количества штамма по п.1.

— относительно высокой скоростью роста;

Особенности антибактериальной терапии неспецифических анаэробных инфекций

*Импакт фактор за 2017 г. по данным РИНЦ

Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.

Читайте в новом номере

ГКБ № 23 им. «Медсантруд», Москва

А наэробные бактерии представляют собой разные группы микроорганизмов (рис. 1), способных удовлетворять энергетические потребности при отсутствии кислорода (не более 0,5% для строгих анаэробов и от 2 до 8% для умеренно облигатных анаэробов [1]).

Рис. 1. Рабочая классификация клинически значимых анаэробов

Анаэробы формируют нормальную микрофлору человека и в отдельных локусах (прямая кишка, ротовая полость) превышают на несколько порядков число аэробных (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. и др.) и факультативно анаэробных (семейство Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp. и др.) микроорганизмов (табл. 1). С практической точки зрения важно знать, какие группы анаэробов колонизируют разные участки тела, так как большинство анаэробных инфекций эндогенного происхождения и анаэробы распространяются из места своего обитания в прилежащие стерильные ткани, где развивается инфекционный процесс. Например, анаэробы группы Bacteroides fragilis колонизируют толстый кишечник и наиболее часто связаны с развитием интраабдоминальных инфекций. Prevotella spp., Porphiromonas spp. и Fusobacterium spp. обитают в верхнем отделе дыхательного тракта и поэтому чаще встречаются среди возбудителей плевролегочных инфекций. Actinomyces spp. колонизируют верхние дыхательные пути и ЖКТ, в связи с чем способны вызывать актиномикозы шейно-лицевой, торакальной и абдоминальной локализации.

Экзогенные анаэробные моноинфекции встречаются относительно редко и в основном связаны с клостридиями. Обычно это пищевые отравления, ботулизм, столбняк, гастроэнтерит и некротический энтерит, мионекроз.

Клостридии. Газовая гангрена (мионекроз) является классической раневой анаэробной инфекцией, вызываемой гистотоксическими клостридиями. Среди них ведущую роль играет C. perfringens (80%), в меньшей степени C. novyi (40%), C. septicum (20%), далее следуют C. histolyticum и C. bifermentans [3]. Гемокультура выделяется у 15% больных [4]. При скальпированных ранах с вовлечением мышечной и других мягких тканей при участии C. perfringens возникает анаэробный целлюлит, также сопровождающийся газообразованием, но в отличие от мионекроза мышцы сохраняют жизнеспособность [5]. К развитию инфекции часто подключаются E. coli, Peptostreptococcus spp, Bacteroides spp. и другие бактерии. Неклостридиальный крепитирующий целлюлит отличается по клинике и более широким спектром ассоциаций возбудителей: Peptostreptococcus spp, Streptococcus spp., S. aureus, E. coli, Klebsiella spp, Proteus spp., Prevotella spp., Porphiromonas spp., группа Bacteroides fragilis. При обеих формах целлюлита в пораженных тканях скапливаются нерастворимые в воде водород и азот, что создает условия для реализации анаэробного пути метаболизма бактерий [6].

У больных с обструктивными или перфоративными повреждениями терминальных отделов подвздошной и толстой кишки клостридии (в первую очередь C. perfringens и C. septicum [7]) участвуют в развитии перитонита, интраабдоминального абсцесса, септицемии. Бактериемия, обусловленная C. septicum, наблюдается у 70-85% больных с карциномой толстой кишки, лейкемией или лимфомой [7]. C. perfringens выделяется из вагины у 1-9% здоровых беременных и небеременных женщин, поэтому возможно возникновение инфекции, чаще после криминального аборта [8]. Токсигенные штаммы C. difficile, колонизирующие толстый кишечник, вызывают псевдомембранозный колит, который лечится приемом внутрь метронидазола или ванкомицина.

Бензилпенициллин остается препаратом выбора при клостридиальной инфекции. Редко возникающая к нему резистентность у C. perfringens связана с модификацией ПСБ 1 (пенициллинсвязывающий белок) [9]. Резистентность заметно выше у C. ramnosum, C. clostr >b -лактамазы [10]. Высокоактивны и другие b -лактамы: пиперациллин, ампициллин/сульбактам, имипенем; из препаратов других групп — метронидазол, хлорамфеникол.

Неспороносные грамположительные анаэробы очень чувствительны к действию кислорода даже при использовании транспортных сред и в отличие от других анаэробов при посеве растут более 48 ч, в связи с чем, их значение в патологии часто недооценивается. Среди палочковидных бактерий актиномицеты являются наиболее наглядными условными патогенами, вызывающими актиномикозы разной локализации (в основном экзогенного происхождения). Mobiluncus curtisii и M. mulieris имеют отношение к возникновению бактериального вагиноза (в ассоциации с Gardnerella vaginalis). Eubacterium spp. входят в состав фекальной флоры и иногда вызывают раневую инфекцию и эндокардит. Бифидобактерии и лактобациллы колонизируют толстый кишечник, где снижение их пороговой концентрации сопровождается явлениями дисбактериоза, и вегетируют в ротовой полости; в редких случаях, выходя за пределы своей экологической ниши, они могут вызвать плевропневмонию. Пропионобактерии обитают на коже, а Propionobacterium acnes служит причиной появления угревой сыпи и может вызывать катетерную инфекцию.

Большинство палочковидных анаэробов чувствительны к карбокси- и уреидопенициллинам, цефокситину, карбапенемам и хлорамфениколу. Mobiluncus curtisii и M. mulieris чувствительны к ампициллину, цефалоспоринам, клиндамицину, эритромицину, ванкомицину и резистентны к метронидазолу (МИК90=256 мкг/мл) [11]. Метронидазол не активен против Actinomyces spp. и Propionobacterium spp. (МИК90 варьирует от 25 до >125 мкг/мл), но 92% культур Eubacterium spp. сохраняют к нему чувствительность [12].

Пептострептококки наиболее широко представлены в качестве возбудителей анаэробных инфекций. С ними тесно связана этиология послеродового эндометрита: Peptostreptococcus magnus (41%), P. tetradius (26%), P. asaccharoliticus (20%), P. anaerobius (19%), P. prevotii (15%), P. niger (4%) [13]. Они часто выделяются при тубоовариальных абсцессах, воспалительных заболеваниях органов малого таза, септическом аборте, амнионите и хориоамнионите [14], нередко в ассоциациях с Prevotella spp., Porphiromonas spp., E. coli, Streptococcus spp., а также при периодонтитах, хроническом среднем отите, хроническом синусите, абсцессе мозга. При их аспирации из ротовой полости возникают пневмониты, некротизирующая пневмония, легочные абсцессы, эмпиема плевры (часты ассоциации со стрептококками и кишечной палочкой). Перечисленные заболевания нередко сопровождаются бактериемией. При перитонитах пептострептококки участвуют в смешанных инфекциях. P. magnus играет важную роль при инфекциях костей и суставов, катетерной инфекции.

До 96% культур пептострептококков чувствительны к b -лактамам, несколько ниже чувствительность к клиндамицину и метронидазолу (84 и 88%, соответственно) [12].

Грамотрицательные анаэробы выделяются более чем у 50% больных при неспецифических инфекциях. Среди них ведущее положение занимает группа Bacteroides fragilis, включающая разные виды, из которых наибольшее клиническое значение имеют B. fragilis и B. thetaiotaomicron, прежде всего при абдоминальных инфекциях, а также инфекциях других локализаций. Бактероиды группы fragilis превалируют среди нормальной микрофлоры ЖКТ, в незначительном количестве встречаются в нижних отделах генитального тракта и практически отсутствуют в ротовой полости и среди микрофлоры верхних дыхательных путей (ВДП). Они продуцируют бета-лактамазы, что определяет профиль их антибиотикоустойчивости.

Так называемые пигментированные грамотрицательные анаэробные палочки (прежде относились к группе Bactero >b -лактамным антибиотикам, включая пенициллины, аминопенициллины, цефалоспорины [16].

Fusobacterium nucleatum обычно встречаются во рту, генитальном тракте, ЖКТ, ВДП и могут вызывать абсцессы мозга, легких, септический артрит и другие инфекции соответствующей локализации. Fusobacterium necroforum отличается высокой вирулентностью и является возбудителем тяжелого тонзиллофарингита у детей и лиц молодого возраста (ангина Венсана), вплоть до образования метастатических абсцессов в легких, плевральной полости, печени, крупных суставах, сопровождающихся бактериемией [17].

Грамотрицательные кокки — Acidaminococcus spp., Megasphaera spp., Veillonella spp. — являются частью фекальной флоры и ротовой полости и очень редко вызывают инфекции мягких тканей после укусов человека и животных, а также инфекции в области головы и шеи [18].

Таким образом, фактически все системы и органы могут подвергаться анаэробной инфекции (табл. 2). Исключение составляет мочевой тракт, кроме редких случаев предрасполагающих анатомических аномалий или инвазивных вмешательств. Несмотря на пестроту анаэробных инфекций, большинство из них вызываются ограниченным кругом анаэробов, из которых около половины представлены группой Bacteroides fragilis, пептострептококками и фузобактериями. Некоторые анаэробы выделяются редко и связаны с вполне определенными заболеваниями: Clostridium septicum (колоректальный рак), Fusobacterium necroforum (ангина Венсана) Propionobacterium acnes или Peptostreptococcus magnus (катетерные инфекции) Mobiluncus spp. (бактериальный вагиноз), Bilophila wadsworthia (относительно новый род) [22] — аппендицит.

Подходы к этиологической диагностике анаэробных инфекций. Отличительной особенностью неспецифических анаэробных инфекций является их полимикробная этиология с участием аэробных и факультативно анаэробных бактерий — представителей нормальной микрофлоры. Это в значительной мере усугубляет и без того сложную проблему этиологической диагностики анаэробных инфекций. Без соблюдения специальных требований к взятию материала, условий его транспортировки и использования отработанной технологии изучения в лаборатории трудно оценить истинную роль анаэробов в патологии. Достаточно сказать, что удлинение сроков между получением материала и его посевом в анаэробных условиях губительно сказывается на жизнедеятельности микроорганизмов (рис. 2). При этом контаминирующая грамотрицательная флора быстро размножается, что искажает конечные результаты анализа. Так как исследование на анаэробы требует дополнительных временных и материальных затрат, оно не всегда доступно в рутинной практике, поскольку нередко трудно соблюсти баланс между получением всеобъемлющей микробиологической информации в изучаемом образце и сроками проведения анализа, когда его результаты еще не утратили значения.

Рис. 2. Влияние сроков транспортировки биоматериалов на высеваемость разных групп бактерий

Показания к обследованию на анаэробы ограничиваются следующими патологическими состояниями:

— сепсис неясной этиологии;

— гангрена, абсцессы, флегмона;

— нагноения ран с подозрением на анаэробную инфекцию.

Анаэробную инфекцию можно заподозрить по ряду косвенных признаков. Это прежде всего наличие заболевания, прочно ассоциируемого с анаэробной этиологией (периодонтит, аспирационная пневмония, интраабдоминальная инфекция, раны после укусов животных и человека), и клинических условий, связанных с деструкцией тканей и бедным их кровоснабжением (при травме, злокачественных новообразованиях). Существенную роль играет близкая локализация инфекции к поверхности слизистых оболочек, газообразование в ткани, формирование абсцесса, гнилостный запах отделяемого. И, наконец, обнаружение гранул серы в содержимом гайморовых пазух наводит на мысль об актиномикозе. Однако ни один из перечисленных признаков не является специфичным, и для объективного подтверждения анаэробной инфекции требуется посев соответствующих биоматериалов. Материалами для исследования служат:

кровь, ликвор (особенно, если он мутный), плевральная, перитонеальная, синовиальная жидкости;

гной из абсцессов и других закрытых полостей (транспортируют в шприце с полностью вытесненным воздухом и согнутой у основания иглой). Если объем гноя превышает 2 мл, то в пробирке под резиновой пробкой сохраняются относительно анаэробные условия в течение нескольких часов;

материалы из глубоких отделов свища (после очистки и асептической обработки наружного отверстия) и ран. Если нет возможности использовать метод аспирации шприцом, материал берут стерильным ватным тампоном, который помещают в анаэробную среду сохранения и до транспортировки в лабораторию содержат при комнатной температуре;

фрагменты костной и мышечной ткани размером 1х1 см, взятые из глубокого очага воспаления во время операции. Если сроки доставки материалов в лабораторию превышают 15-20 мин, фрагменты тканей погружают в небольшой объем стерильной смеси, состоящей из цитратной донорской крови и 90% стерильного изотонического раствора хлористого натрия.

Не подлежат исследованию на анаэробы:

— отделяемое поверхностных ран, язв;

— мазки из зева, носа, ротовой полости;

— мазки из влагалища, цервикального канала;

— мокрота, бронхиальные смывы;

— моча (кроме мочи, полученной надлобковой пункцией мочевого пузыря);

— содержимое желудка, тонкого и толстого кишечника;

Основы антибактериальной терапии анаэробных инфекций. Учитывая трудоемкость и длительность получения результатов, определение чувствительности анаэробов к антибиотикам, согласно Международным рекомендациям [23] показано при выделении:

— анаэробных гемокультур и штаммов из ликвора;

— изолятов в чистой культуре и от больных, неподдающихся антибиотикотерапии;

— штаммов при инфекциях, требующих длительного лечения (особенно, когда мониторинг затруднен, как при остеомиелитах).

Обычно используют метод разведений в агаре, микро- (на плашках) и макро- (в пробирках) разведений в бульоне.

Поскольку антианаэробная терапия чаще всего проводится эмпирически, важно знать тенденции формирования резистентности клинических изолятов к антимикробным препаратам (табл. 3).

Европейские данные по группе Bacteroides fragilis, как и результаты отечественных исследователей, свидетельствуют о неэффективности ампициллина и снижении активности цефокситина (антибиотик из группы цефамицинов, отличающихся антианаэробным спектром), более выраженной в Российском регионе, несмотря на то, что этот препарат не применяется в отечественной практике. Обращает внимание рост устойчивости бактероидов к клиндамицину, единичные штаммы резистентны к имипенему. Метронидазол (Метрогил) сохраняет свою активность против разных групп анаэробов (как указывалось выше, исключение составляют актиномицеты и пропионобактерии) и имеет целый ряд преимуществ по сравнению с другими антианаэробными препаратами.

Обладая бактерицидной активностью, метронидазол хорошо сочетается с b -лактамами, аминогликозидами, фторхинолонами, макролидами, ванкомицином, сульфаниламидами, ко-тримоксазолом, что особенно важно при комбинированной терапии инфекций полимикробной этиологии, каковыми являются неспецифические анаэробные инфекции. При тяжелых формах инфекций с участием анаэробов возможна ступенчатая терапия, хотя и изначальное проведение пероральной терапии достаточно эффективно ввиду высокой биодо ступности метронидазола. Хорошее проникновение в органы и ткани (70-94% от сывороточных концентраций [26]), в том числе в ткани мозга (концентрация в гное абсцесса мозга достигает 35 мг/л [27]) и поджелудочную железу (наряду с фторхинолонами и карбапенемами создаются концентрации, превышающие МИК для большинства возбудителей [28]), выгодно отличает метронидазол от других антимикробных средств и позволяет применять его практически при любой локализации инфекции или гнойно-воспалительного процесса. Метронидазол (Метрогил) является важным средством для лечения тяжелых генерализованных форм инфекций, включая инфекции ЦНС.

Имеется широкий перечень показаний для его применения: некротические инфекции мягких тканей; хронические остеомиелиты и септический артрит; интраабдоминальные инфекции (перитонит, внутрибрюшинный абсцесс, абсцесс печени, инфекция желчного пузыря); инфекции в области малого таза (эндометрит, пельвиоперитонит, инфицированный аборт и др.); анаэробные эндокардиты; инфекции дыхательных путей (абсцесс легкого, эмпиема плевры); инфекции полости рта и околозубных тканей; профилактика анаэробной инфекции при хирургических вмешательствах в колоректальной области, на желчном пузыре, в области малого таза, в ротовой полости. Метронидазол применяют для лечения псевдомембранозного колита (C. difficile) и некротического колита, вызванного C. perfringens, а также неспецифического язвенного колита и болезни Крона, при которых возможна активация анаэробной флоры.

При многоцентровом рандомизированном двойном слепом исследовании эффективности лечения тяжелых интраабдоминальных инфекций комбинацией метронидазола с ципрофлоксацином при инфузионной и ступенчатой терапии в сравнении с имипенемом были получены одинаковые показатели исходов заболеваний в группах сравнения (82-84% излечения) [29], но фармакоэкономические преимущества были на стороне комбинированной ступенчатой терапии метронидазолом и ципрофлоксацином [30].

При лечении инфекций полимикробной этиологии подбор антибактериальных препаратов осуществляют с таким расчетом, чтобы по возможности максимально перекрыть спектр наиболее значимых предполагаемых возбудителей. Это особенно важно для анаэробов, поскольку чаще всего, в отсутствие микробиологических возможностей, ни подтвердить, ни опровергнуть их наличие в биоматериалах в ранние сроки не представляется возможным. Обычная практика применения метронидазола при тяжелых смешанных инфекциях подразумевает его комбинацию с ципрофлоксацином, либо с цефалоспоринами III-IV поколений (цефотаксим, цефтриаксон, цефтазидим, цефоперазон, цефепим) или с аминогликозидами (амикацин, нетилмицин). Из других лекарственных средств, обладающих антианаэробной активностью, часто используют ингибиторзащищенные аминопенициллины (ампициллин/сульбактам и амоксициллин/клавуланат, например, при хроническом синусите, хроническом среднем отите), пиперациллин/тазобактам (в основном при интраабдоминальных инфекциях и гнойно-воспалительных процессах в малом тазу), линкозамиды (клиндамицин и гораздо чаще применяемый в России линкомицин) в комбинации с антибиотиками широкого спектра, карбапенемы (имипенем или меропенем) при проведении монотерапии. Перспективными препаратами в лечении анаэробных инфекций за счет широкого антимикробного спектра являются цефоперазон/сульбактам и моксифлоксацин.

Выбор схемы лечения во многом зависит от локализации первичного очага и характера инфекции, тяжести состояния больного, средней продолжительности лечения соответствующей нозологической формы заболевания, медико-экономических возможностей лечебного учреждения. Имеющиеся отечественные руководства последнего периода по антибактериальной терапии [31,32] содержат конкретные рекомендации по применению современных средств в лечении широкого круга неспецифических гнойно-воспалительных заболеваний, в том числе анаэробных инфекций.

1. Loesche W.R. Oxygen sensitivity of various anaerobic bacteria // Appl.Microbiol. — 1969. — V.18. — P.723-727.

2. Bartlett J.G. Anaerobic bacteria: general concepts. / Ed: Mandell J.L., Douglas R.J., Bennett J.E. Principles and practices of infectious diseases: Churchill Livingstone, N.Y., 1990. — 3rd ed. — P.1828-1848.

3. Swartz M.N. Myositis / Ed: Mandell J.L., Douglas R.J., Bennett J.E. Principles and practices of infectious diseases: Churchill Livingstone, N.Y., 1990. — 3rd ed. — P.812-818.

4. Gorbach S.L. Other Clostridium species (including gas gangrene) / Ed.: Mandell G.L., Douglas R.G., Bennett J.E. Principles and practice of infectious diseases: John Wiley&Sons, Inc., N.Y., 1979. — P.1876-1885.

5. Swartz M.N. Subcutaneous tissue infections and abscesses / Ed: Mandell J.L., Douglas R.J., Bennett J.E. Principles and practices of infectious diseases: Churchill Livingstone, N.Y., 1990. — 3rd ed. — P.808-812.

6. Nichols R.L., Smith J.W. Gas in the wound: what does it mean? // Surg.Clin.N.Am. — 1975. — V.55. — P.1289-1296.

7. Kornbluth A.A., Danzig J.B., Bernstein L.H. Clostridium septicum infection and association malignancy // Medicine. — 1989. — V.68. — P.30-37.

8. Decker W.H., Hall W. Treatment of abortions infected with Clostridium welchii. // Am.J.Obstet.Gynecol. — 1966. — V.95. — P.394-399.

9. Hecht D.W., Malany M.H., Tally F.P. Mechanisms of resistance and resistance transfer in anaerobic bacteria / Ed.: Finegold S.M., George W.L. Anaerobic infections in human: Academic Press, Inc, San Diego, Calif., 1989. — P.755-769.

10. Finegold S.M. Therapy of anaerobic infections / Ed.: Finegold S.M., George W.L. Dorsher C.W., Wilson W.R., Rosenblatt J.E. Anaerobic bacteremia and cardiovascular infections / Ed.: Finegold S.M., George W.L. Anaerobic infections in human: Academic Press, Inc, San Diego, Calif., 1989. — P.289-310.

11. Spiegel C.A. Susceptibility of Mobiluncus species to 23 antimicrobial agents and 15 other compounds // Antimicrob.Agents Chemother. — 1987. — V.31. — P.249-252.

12. Whiting J.L., Cheng N., Chow A.W. Interactions of ciprofloxacin with clindamycin, metronidazole, cefoxitin, cefotaxime, and mezlocillin against gram-pozitive and gram-negative anaerobic bacteria // Antimicrob.Agents Chemother. — 1987. — V.31. — P.1379-1382.

13. Hillier S.L., Watts D.H., Lee M.F., Eschenbach D.A. Etiology and treatment of post cesarean sections endometritis following cephalosporin prophylaxis // Reprod.Med. — 1990. — V.35. — P.322-328.

14. Hillier S.L., Martius J., Krohn M., et al. A case-control study of chorioamnionic infection ad histologic chorioamnionitis in prematurity // N.Engl.J.Med. — 1988. — V.319. — P.972-978.

15. Shah H.N., Collins M.D. Proposal to restrict the genus Bacteroides (Castellani and Chalmers) toBacteroides fragilis and closely related species // Int.J.syst.Bacteriol. — 1989. — V.39. — P.85-87.

16. Shah H.N., Collins M.D. Prevotella, a new genus to include Bacteroides melaninogenicus and related species formally classified in the genus Bacteroides // Int.J.syst.Bacteriol. — 1989. — V.40. — P.205-208.

17. Moreno S., Altozano J.G., Pinilla B., et al. Ltmierre’s disease: postangial bacteremia and pulmonary involvement caused by Fusobacterium necrophorum. // Rev.Infect.Dis. — 1989. — V.11. — P.319-324.

18. SutterV.L., Citron D.M., Edelstein M.A., Finegold S.M. Wadsworth anaerobic bacteriology manual: Star Publishing Co., Belmont, Calif, 1985. — 4th ed.

19. Dorsher C.W., Wilson W.R., Rosenblatt J.E. Anaerobic bacteremia and cardiovascular infections / Ed.: Finegold S.M., George W.L. Anaerobic infections in human: Academic Press, Inc, San Diego, Calif., 1989. — P.289-310.

20. Finegold S.M., Wexler H.M. Therapeutic implications of bacteriologic findings in mixed aerobic-anaerobic infections // Antimicrob.Agents Chemother. — 1988. — V.32. — P.611-616.

21. Sutter V.L., Citron D.M., Edelstein M.A., Finegold S.M. Wadsworth anaerobic bacteriology manual: Star Publishing Co., Belmont, Calif, 1985. — 4th ed.

22. Baron E.J., Summanen P., Downes J., et al. Bilophila wadsworthia gen. nov., sp. nov., a unique gram-negative anaerobic rod recovered from appendicitis specimens and human faeces // J.Gen.Microbiol. — 1989. — V.135. — P.3405-3411.

23. Wexler H.M., Finegold S.M. Antibacterial susceptibility tests: anaerobic bacteria / Ed.: Balows A., Hausler W.J., Herrman K.L. et al. Manual of clinical microbiology: Am.Soc.Microbiol, Washington, 1991. — 5th ed. — P.1133-1137.

24. Sidorenko S.V., Rezvan S.P., Tikchonova A.S. et al. In vitro activity of ampicillin, cefoperazone, their combinations with sulbactam and other antimicrobials: survey of Russian isolates // Inern.J. Antimicrob. Agents. — 1996. — V.7. — P.109-117.

25. Hedberg M., Nord C.E. Antimicrobial susceptibility of Bacteroides fragilis group isolates in Europe // Clin.Microbiol.Infect. — 2003. — V.9. — P.475-488.

26. Freeman C.D., Klutman N.E., Lamp K.C. Metronidazole. A therapeutic review and update // Drugs. — 1997. — V.54. — P.679-708.

27. Barling R,W,, Selkton J.B. The penetration of antibiotics into cerebrospinal fluid and brain tissue // J.Antimicrob.Chemother. — 1978. — V.4. — P.203-227.

28. Bassi C., Pederzoli P., Vesentini S., et al. Behavior of antibiotics during human necrotising pancreatitis // Antimicrob. Agents Chemother. — 1994. — V.38. — P.830-836.

29. Solomkin J.S., Reinhart H.H., Dellinger E.P. et al. Results of randomized trial comparing sequential intravenous/oral treatment with ciprofloxacin plus metronidazole to imipenem/cilastatin for intra-abdominal infections // Ann.Surg. — 1996. — V.223. — P.303-315.

30. Walters D.J., Solomkin J.S., Paladino J.A. Cost effectiveness of ciprofloxacin plus metronidazole versus imipenem-cilastatin in the treatment of intra-abdominal infections // Pharmacoeconomics. — 1999. — V.16. — P.551-561.

31. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. Под ред. Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н. , Москва, 2002. — 381 с.

32. Зубков М.Н. Практическое руководство по клинической микробиологии и антимикробной терапии для врачей стационарной помощи. Москва, 2002. — 270 с.

22. Baron E.J., Summanen P., Downes J., et al. Bilophila wadsworthia gen. nov., sp. nov., a unique gram-negative anaerobic rod recovered from appendicitis specimens and human faeces // J.Gen.Microbiol. — 1989. — V.135. — P.3405-3411.

http://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/megasphaerahttp://1analiz.ru/femoflor.htmlhttp://findpatent.ru/patent/236/2365621.htmlhttp://www.rmj.ru/articles/antibiotiki/Osobennosti_antibakterialynoy_terapii_nespecificheskih_anaerobnyh_infekciy/

Давайте сделаем материал еще популярнее, поэтому после прочтения сделайте репост в любую из удобных для Вас социальных сетей

.

Читайте также:  7 Недель Эмбрионалтной Беременности
Оцените статью
Лучшая мама поможет всегда — в любой ситуации